Silenciamiento génico mediado por shrnas en células del epitelio seminífero de ratón

Resumen

Las espermatogénesis es el proceso de diferenciación terminal que conduce a la formación de los espermatozoides. En la línea germinal masculina, las espermatogonias proliferan y se diferencian a los restantes tipos celulares del epitelio de los túbulos seminíferos del testículo: espermatocitos, espermátidas y espermatozoides. El proceso está coordinado por el componente somático del epitelio seminífero: las células de Sertoli. En este trabajo, se ha evaluado el silenciamiento de la expresión génica mediante interferencia de RNA (RNAi), en los distintos tipos celulares del epitelio seminífero de ratón (Mus musculus). En el silenciamiento por RNAi, moléculas de RNA de doble cadena son capaces de promover represión post-transcripcional de un gen diana por complementariedad de secuencia. En las células del epitelio seminífero de ratones transgénicos que expresan el gen Egfp, se introdujeron vectores de DNA que permitían la expresión de pequeños RNAs, capaces de constituirse en RNAs de doble cadena en horquilla (shRNAs), con potencialidad de guiar el silenciamiento especifico del gen Egfp. La transfección de los vectores en las células del epitelio seminífero se llevó a cabo in vivo, mediante electroporación por onda cuadrada, e in vitro, mediante lipofección. En ambos casos se analizó la eficacia de transfección del vector utilizado y la eficiencia del silenciamiento. También, en este trabajo, se ha llevado a cabo la caracterización, utilizando la técnica de RT-PCR en Tiempo Real, de la expresión de los genes Drosha, Dicer y Ago 1-4; genes que codifican proteínas implicadas en el proceso de interferencia de RNA. El estudio se ha realizado valorando comparativamente los niveles de expresión génica durante el desarrollo postnatal del testículo, en las células aisladas del epitelio seminifero y en diferentes tejidos somáticos adultos. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral muestran que, utilizando la metodología de