Expresión heteróloga y estudios estructura-función de una nueva peroxidasa versátil de pleurotus eryngii

Resumen

En esta tesis se han abordado estudios estructura-función de un nuevo tipo de peroxidasa producida por el hongo ligninolítico Pleurotus eryngii, denominada peroxidasa versátil (VP). Esta hemoproteína se caracteriza por su amplia especificidad de sustrato, que incluye desde el Mn2+ hasta compuestos aromáticos fenólicos y no fenólicos o colorantes de tipo azo. Se ha desarrollado un sistema de expresión heteróloga de la VP en Escherichia coli, situando el cDNA correspondiente a la proteína madura en el vector de expresión pFLAG1. La proteína expresada se acumuló en forma de cuerpos de inclusión, que se aislaron y solubilizaron en presencia de urea, para realizar posteriormente el plegamiento in vitro de la peroxidasa recombinante. Se investigó la influencia de diferentes parámetros en la reacción de plegamiento, como el pH, las condiciones redox y la concentración de proteína, urea e iones calcio. El protocolo optimizado permite recuperar hasta un 10% de enzima en forma activa, un rendimiento tres veces superior al obtenido para otras peroxidasas estructuralmente similares. Asimismo se han realizado estudios mediante la técnica de stopped-flow para la caracterización espectroscópica del ciclo catalítico y el análisis de la cinética del estado transitorio de la reacción de la VP con el H2O2 y el alcohol veratrílico (VA), que es uno de sus sustratos reductores. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto unas propiedades de los intermediarios de oxidación (compuestos I y II) muy similares a las de otras peroxidasas estudiadas. Se ha calculado la constante de formación del compuesto I a distintos valores de pH, así como las constantes de formación y reducción del compuesto II por el VA. Los estudios de NMR de la proteína en disolución y difracción de rayos X tras obtención de cristales proporcionaron información estructural precisa de la VP. Los espectros de NMR de la VP mostraron que el entorno d