Estudio de la regulación del gen GF11B y su influencia en la hematopoyesis

Resumen

Los factores de trascripción desempeñan un papel esencial en la hematopoyesis normal y en las neoplasias hematológicas. Entre ellos se encuentra GFI1B. Éste es un factor indispensable para la eritropoyesis y la megacariopoyesis que se ha encontrado en unos niveles superiores a lo normal en leucemia, tanto en pacientes, como en líneas celulares. Uno de nuestros objetivos principales ha sido identi?car los elementos reguladores a distancia de GFI1B y conocer su efecto sobre la expresión de este gen. Al comienzo de este estudio, solo se conocía su regulación a nivel del promotor. Otro objetivo ha sido el estudio de las variaciones de la secuencia del gen GFI1B y su posible implicación en patología humana. En primer lugar, hemos investigado la homología de la secuencia de ADN entre los genes que rodean a G?1b hasta identi?car elementos conservados en múltiples especies no codi?cantes (ECNC). A continuación hemos empleado las técnicas de Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) y ADNasaI para determinar el estado de la cromatina en dichos ECNC. Posteriormente, hemos analizado la unión de factores de trascripción y modi?caciones de las histonas mediante inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) en el locus de G FI1B incluyendo los ECNC. Finalmente, hemos estudiado la interacción de los ECNC con el promotor de GFI1B mediante Chromosome Conformation Capture (3C) y evaluado el nivel de GFI1B en células individuales mediante inmuno?uorescencia. En segundo lugar , hemos investigado la posible implicación de polimorfismos de un nucleótido y mutaciones puntuales del gen GFI1B con patología humana. Para llevarlo a cabo se estudiaron 214 pacientes y 96 controles mediante DHPLC. A continuación, realizamos la secuenciación de las dos mutaciones congénitas encontradas y su conservación a través de la evolución. También, se estudió la unión de las secuencias normales y de ambas mutaciones en los diferentes complejos de proteínas por el método EMSA. Posteriormen te, se realizó el estudio in Vitro de estas mutaciones (estudio funcional del promotor). Por último, se estudió como afecta la mutación -8092 (T/C) a las líneas eritroides y megacariocitas, realizando el estudio de una familia afectada con esta mutac ión, cuantificando el nivel de ARNm de GFI1B en los eritrocitos y megacariocitos mediante PCR en tiempo real. En la primera parte de este estudio, hemos localizado diversos ECNC en el locus de GFI1B que contienen numerosas secuencias de...