Análisis genético y bioquímico del catabolismo del colesteroel en mycobacterium smegmatis mc2 155

Resumen

El trabajo realizado en esta Tesis se ha centrado en el estudio de la ruta aeróbica de degradación del colesterol en la bacteria Mycobacterium smegmatis mc2155. Con el fin de hallar los genes responsables del catabolismo de este esteroide, se analizó primeramente el genoma de esta cepa mediante análisis in silico, utilizando para ello como sondas genes de otros microorganismos que están implicados en la degradación de esteroides (como por ejemplo los genes tes de Comamonas testosteroni (Horinouc hi et al (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69, 4421-4430). Los resultados indicaron que en el genoma de M. smegmatis mc2155 aparecían supuestos genes ortólogos a la mayoría de las sondas utilizadas. Posteriormente mediante la técnica de retrotranscripción-PCR se confirmó que efectivamente esos genes se expresan diferencialmente cuando la bacteria se cultiva en un medio con colesterol 1,8 mM como fuente de carbono y energía, frente a un medio con glicerol 18 mM, lo que apoya su implicación en la ruta de degradación de este esterol. Seguidamente se procedió a un estudio global de la expresión génica diferencial en colesterol de M. smegmatis mc2155 utilizando la tecnología de los microarrays. Para ello se cultivó la cepa en medio con colesterol 1,8 mM o glicerol como única fuente de carbono, y tras extraer RNA del cultivo y efectuar la retrotranscripción-PCR para conseguir cDNA se procedió al marcaje del mismo con los fluorocromos Cy3/Cy5. Posteriormente se hibridó este cDNA marcado a microarrays de M. smegmatis. Tras la hibridación se escanearon las imágenes y se procesaron y se analizaron los datos obtenidos utilizando distintos métodos informáticos, como RANK product o LIMMA. Los datos obtenidos han servido para delimitar las zonas del genoma de M. smegmatis mc2155 implicadas en el metabolismo de colesterol. Algunos de los datos obtenidos en los microarrays se habían obtenido ya con anterioridad mediante la técnica de retrotranscripción-PCR, lo que apoya la fiabilidad de los mismos, y otros son datos nuevos que han servido para localizar nuevos genes desconocidos hasta la fecha posiblemente implicados en esta ruta. Varios de ellos fueron inactivados mediante mutagénesis insercional y se comprobó que su ausencia afectaba al crecimiento de esta cepa en colesterol. Tal es el caso por ejemplo del gen MSMEG_5995, que codifica un citocromo P450 que se cree que puede estar implicado en el primer paso de la degradación de la cadena lateral del colesterol, o del gen MSMEG_13...