Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa de hígado de lubina (Dicentraschus labrax. L)purificación, estudios cinéticos y de regulación

Resumen

Ha sido aislada y purificada hasta homogeneidad la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa de hígado de lubina mediante precipitación fraccionada con sulfato amónico y cromatrografias en columna de sephacryl s-300 deae-sephacel y 2'5'-adp-agarosa. El peso molecular de la enzima nativa ha resultado ser de 140.000 y el de las subunidades de 68.000. El ph de máxima actividad es de 7 6 idéntico al valor de ph al que esta enzima es mas estable. Se ha demostrado que el nadp estabiliza a la enzima a phs alcalinos y ácidos. La glucosa 6-fosfato y especialmente el nadp protegen a la enzima de la desnaturalización térmica. Los estudios de actividad en función de la temperatura indican que la enzima se encuentra en dos formas conformacionales activas y con diferente energía de activación. Los estudios cinéticos han mostrado que la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa cataliza la reacción en estado estacionario mediante un mecanismo ordenado de adición de sustratos y de liberación de productos: en primer lugar se une a la enzima libre el nadp y a continuación la glucosa 6-fosfato para formar el complejo ternario el cual sufre un cambio conformacional que tras la catálisis libera en primer lugar la 6-fosfogluconato lactona y a continuación el nadph con el consiguiente retorno de la enzima al estado conformacional primario. El fenómeno de isomerización que se produce es función de la concentración de nadph. Los estudios de inactivación por tripsina de la enzima han mostrado que el nadp posee un papel estructural en este sistema enzimático pues es responsable de un cambio conformacional que protege a la enzima de la inactivación tríptica. El lugar de unión que produce este fenómeno es diferente del centro catalítico sugiriéndose la existencia de un centro estructural para el nadp en la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa. Mediante piridoxal 5'-fosfato se ha mostrado la existencia de un residuo de lisina en el centro activo para el nadp. El nadh atp pep y