Caracterización de una isoforma de cdpk que participa en respuestas de defensa en plantas de tomate lycopersicon esculentum

Resumen

El estudio abarca un enfoque bioquímico y molecular. En el estudio bioquímico se identificó por primera vez una actividad de quinasa de proteínas dependiente de calcio (CDPK) en extractos obtenidos a partir de hojas de tomate. La actividad de la proteína es dependiente de concentraciones micromolares de calcio. Se inhibe con EGTA y en presencia de calcio con los inhibidores estaurosporina, cloropromacina y W7. La actividad fue detectada en las fracciones solubles y particuladas de extractos crudos. Mediante ensayos de Western blot se identificó una CDPK de 58 kDa en ambas fracciones. Por otro lado la proteína parcialmente purificada de los extractos solubles tiene la capacidad de autofosforilarse. En este estudio molecular se hizo el rastreo de una biblioteca de ADNc de células de tomate que habían sido tratadas con elicitores de Cladosporium fulvum. Se obtuvo un clon positivo al que se denominó LeCDPK1, por ser la primera isoforma encontrada en esta especie. Esta isoforma presenta todos los dominios característicos de la familia las CDPKs, tiene un peso molecular estimado de 58 kDa y en su dominio característico de la familia las CDPKs, tiene un peso molecular estimado de 58 kDa y en su dominio amino terminal se puede observar una secuencia consenso de miristoilación y palmitoilación respectivamente. Utilizando un sistema de transcripción y traducción in vitro se obtuvo la proteína recombinante correspondiente que presentó propiedades bioquímicas muy similares a las de la proteína endógena. Estudios de Sothern blot mostraron que el gen es de copia única o de muy bajo número de copias y que probablemente existen muy pocas isoformas relacionadas con la identificada. El ARNm de LeCDPK1 se expresa en raíces, tallos, hojas y flores de plantas de tomate. Hojas de tomate cortadas y expuestas a diferentes señales de defensa o a una suspensión conidial de Colletotrichum cocodes presentan una inducción del mensaj