Clonación del gen dsba de salmonella typhi y salmonella enteritidis y caracterización fenotípica resultante de su inactivación

Resumen

DsbA es una proteína que pertenece a la familia enzimática Trx de tiol-disulfuro óxido-reductasas, localizada en el periplasma bacteriano, y catalizadora de puentes disulfuro. La formación de estos puentes disulfuro es importante para la adquisición de una conformación estable y activa de un número de proteínas extracitosólicas, entre las que se incluyen factores relacionados con la virulencia de bacterias como Escherichia coli, Shigella flexneri o Vibrio cholerae. Previamente, en nuestro laboratorio se habían descrito tres genes de Salmonella (dlp, en el plásmido de virulencia de S.enteritidis, dlt y del en el cromosoma de S.typhi y de S.enteritidis, respectivamente) cuyos productos tienen la secuencia Cys-Xaa-Xaa-Cys característica de las proteínas de la familia Trx, pero que daba su baja homología (33%) con dsbA suponíamos que no correspondían con el alelo de dicho gen. Posteriormente, hemos conseguido clonar los genes dsbA de S.typhi y de S.enteritidis, los cuales presentan una homología del 83% con dsbA de E.coli. Así mismo hemos comprobado que estos genes de Salmonella son capaces de complementar las deficientes fenotípicas descritas en el mutante dsbA::kan (SS140) de E.coli, en cuanto a la disminución de la actividad fosfatasa alcalina y glucosa-1-fosfatasa, crecimiento en presencia de sales de cadmio y zinc, formación de biofilm y, parcialmente, la sensibilidad a DTT 10 mM. Por otra parte, hemos interrumpido del gen dsbA de las cepas 5866 de S.typhi y 366 de S.enteritidis (que carece de plásmido de virulencia), observando que estos mutantes presentan una disminución en la capacidad invasiva y adhesiva en células epiteliales (Henle-407) y en la supervivencia en macrófagos (U-937). La disminución en la invasión y adhesión en Henle-407 es complementada totalmente por los genes dsbA y delp en bajo número de copias; sin embargo la menor supervivencia en U-937 sólo es complementada parcialmente por estos ge