Análisis mutacional del dominio de actividad nucleásica 5¿-3¿de la dna polimerasa i de streptococcus pneumoniae

Resumen

El trabajo de esta Tesis Doctoral se ha centrado en la caracterización de la actividad 5¿de la DNA polimerasa I de Streptococcus pneumoniae. Mediante el análisis mutacional del dominio de actividad nucleasa y la determinación de las actividades enzimáticas de los derivados mutacionales, se ha establecido que mutaciones introducidas en los residuos D10,D190 y E114 afectan sólo las actividades relacionadas con el dominio nucleasa. Los estudios realizados han generado resultados, que indican la función de dichos residuos y apoyan un modelo catalitico que requiere la unión de dos metales (Me1 y Me2). El residuo D190 parece estar implicado en el evento catalítico interaccionado con el metal Me2 requerido para la actividad nucleásica. El residuo E114 estaría implicado en la unión al DNA sustrato y proximo al sitio del Me1. El residuo D10 estaría localizado en las proximidades del sitio Me1, sin interaccionar directamente con el metal, y siendo requerido para la actividad catalítica. El derivado mutacional D10A, carente de actividad nucleásica, ha sido analizado para su utilización en tecnicas de secuenciación de DNA manual y automática. Se ha comprobado que dicha proteína es capaz de elongar oligonucleótidos marcados fluorescentemente que emiten luz en el reango de infrarojo y de incorporar nucleótidos marcados con digoxigenina(marcaje interno) dando un patrón de bandas homogeneo, características que no presentan otras polimerasas, como las del bacteriófago T7 y la de Thermus aquaticus, utilizadas rutinariamente en técnicas de secuenciación.