Generación de células catecolaminérgicas a partir de células tronco neurales expandidas en cultivo

Resumen

Las células tronco neurales dependientes del factor de crecimiento epidérmico (EGF) poseen un gran potencial de autorrenovación, así como un linaje multicelular, lo que las convierte en un excelente modelo para el estudio de las señales implicadas en la regulación de los fenotipos neuronales existentes en el Sistema Nervioso Central (SNC). Estudios realizados sobre otros sistemas celulares como una línea tumoral humana (hNT) o cultivos primarios neuronales procedentes de estriado de rata, han demostrado la acción sinérgica del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y activadores de la proteína kinasa A (PKA) y la PKC en la inducción de la expresión de la enzima tirosina hidroxilasa (TH). El objetivo de la presente memoria de tesis doctoral consiste en caracterizar el desarrollo del cultivo desde un punto de vista fenotípico y dirigir in vitro la diferenciación de las neuronas generadas en los mismos hacia el fenotipo catecolaminérgico, caracterizando los mecanismos intracelulares implicados en este proceso. El proceso de diferenciación espontánea del cultivo demostró que la progenie de las células tronco se ajustó a la generación de los tipos celulares presentes en el SNC adulto, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, según un patrón temporal similar al acontecido en el desarrollo del SNC del embrión. Asimismo, presentó un patrón de expresión de receptores para el FGF característico, con una localización preferente sobre las células gliales generadas en el cultivo. La activación de estos receptores dio lugar a la modificación del patrón de diferenciación espontánea de las células tronco neurales. La acción conjunta del FGFb con activadores de la PKA en este sistema celular indujo la expresión del fenotipo catecolaminérgico, testado por inmunorreactividad a la enzima TH. Esta inducción fue dependiente del estadio de desarrollo del cultivo, siendo efectiva en tiempos avanzados de la diferenciación celular, cuando las células del cultivo presentan marcadores específicos de células neuronales y gliales diferenciadas. El efecto inductor de la expresión de TH ocurre a través de la activación de vías intracelulares que implican la fosforilación de MAPK, ya que la inhibición de su fosforilación con PD980558 abolió totalmente la inducción de TH mediada por FGFb + dbAMPc. La activación de la PKC también está implicada, al menos en parte, en este fenómeno, ya que su inhibición redujo significativamente el número de células TFT generadas por FGFb + dbAMPc. La total activación de la PKC por ésteres de forbol fue suficiente para generar células que expresaron el fenotipo catecolaminérgico, y esta activación potenció sinérgicamente tanto la fosforilación de la MAPK como el número de células TFT del cultivo.