Clonación y caracterización molecular del gen codificante de la dna polimerasa beta nuclear del protozoo parasito leishmania infantum

Resumen

Las DNA polimerasa dependientes de DNA se agrupan en familias denominadas A, B y X en base a su similitud de secuencia. La familia X está constituidad principalmente por las DNA plimerasas beta y las desoxinuleotidil transferasas terminales (TdT). Pol beta es la enzima responsable de la reparación del DNA nuclear en eucariotas mediante le mecanismo de reparación por excisión de una base (BER). Hemos clonado el gen codificante de la proteína DNA pol beta delprotozoo parásito Leishmania infantum. El gen consta de 1131 pares de bases y codifica una proteína de 376 aminoácidos con una masa molecular estimada de 43kDa. Se ha demostrado que la proteína está codificada por un gen de copia única y transcribe un mensajero de 1200 nuleótidos. Los niveles tanto de mensajero como de proteína varían periódicamente a lo largo del ciclo del parásito. Se ha expresado la proteína por cromatografía de afinidad en columnas de agarosa cargada con níquel. La proteína purificada ha sido utilizada para la obtención de un antisuero policlonal en conejo. El suero ha sido utilizado en ensayos de localizaciónpor inmunofluorescencia mostrando una localización nuclear de pol beta, si bien el patrón de localización varía a lo largo del ciclo vital del parásito. Se ha ensayado la actividad DNA polimerasa insitu de la proteína recombinante, así como el fragmento catalítico obtenido por la degradación proteolítica de la proteína completa. Se ha desarrollado unmodelo molecular par la DNA polmersa beta de Leishmania infantum que muestra la estrucura en forma de mano característica común de todas las polimerasas.