Modelling and gene therapy for pyruvate kinase deficiency

Resumen

La deficiencia en piruvato quinasa (PKD, por sus siglas en inglés) es la principal causa de anemia hemolítica no esferocítica. Es una enfermedad monogénica-recesiva que se origina por mutaciones en el gen PKLR. La piruvato quinasa es la enzima que cataliza la última reacción de la glicólisis, un proceso exergónico crucial para la supervivencia energética de los eritrocitos. PKD es considerada una enfermedad rara pues afecta 5 de cada 20.000 personas. La severidad de la enfermedad es variable, desde casos leves que solo necesitan transfusiones de eritrocitos puntuales hasta casos graves dependientes de transfusiones periódicas que incluso pueden causar la muerte. Actualmente solo existe un tratamiento curativo, el trasplante alogénico de médula ósea. La terapia génica es una estrategia alternativa que solventaría limitaciones del trasplante alogénico ya que se basa en un trasplante autólogo de células corregidas. Nuestro grupo demostró corrección de la enfermedad en un modelo múrido de PKD corrigiendo mediante el uso de un vector lentiviral. Además esto nos permitió la aprobación del vector como medicamento huérfano por la las agencias europea y americana del medicamento (EMA y FDA) en 2014 y 2016 respectivamente. Los principales objetivos de este trabajo han sido i) continuar estudiando el alcance de las alteraciones hematopoyéticas en muestras de pacientes, especialmente en el linaje eritroide; ii) averiguar la cantidad mínima de células corregidas capaz de rescatar el fenotipo PKD en un modelo de ratón; y iii) la generación de células deficientes en PK a partir de progenitores hematopoyéticos sanos usando shRNA y CRISPR/Cas9. Muestras de sangre periférica de los pacientes de PKD mostraron que el linaje más afectado fue el eritroide, con un gran incremento en progenitores eritroides y reticulocitos circulantes, clara respuesta de la médula ósea al estrés anémico. También se llevó a cabo un estudio de la posible afectación de los progenitores hematopoyéticos más primitivos. Estos experimentos mostraron un pequeño, aunque no significativo, aumento del número de células CD34+ en el torrente sanguíneo de los pacientes con respecto a los donantes sanos. Respecto al número mínimo de células corregidas necesario para restaurar valores sanos en el modelo animal se vio lo siguiente. Ratones PKD acondicionado fueron trasplantados con progenitores hematopoyéticos que previamente habían sido transducidos con diferentes dosis del vector terapéutico. El fenotipo deficiente fue corregido en los ratones que tenían al menos 0,3 copias de vector por célula. Este resultado nos ha permitido establecer un umbral por encima del cual deben permanecer los niveles de transducción para hacer posible el tratamiento de PKD mediante terapia génica de cara a un futuro ensayo clínico. La generación de células humanas PKD a partir de progenitores hematopoyéticos sanos se llevó a cabo mediante el uso de shRNA y el sistema CRISPR/Cas9. En la aproximación con shRNA, progenitores hematopoyéticos de donantes sanos fueron transducidos con vectores lentivirales conteniendo shRNAs y fueron diferenciados hacia linaje eritroide. Pese a que los vectores utilizados ralentizaban el crecimiento de las células transducidas, estas si mostraron una disminución de la actividad PK. Un procedimiento similar se llevó a cabo en el caso del sistema CRISPR/Cas9. Progenitores hematopoyéticos procedentes de donantes sanos fueron electroporados con la Cas 9 y con las guías de RNA específicas para regiones del gen PKLR. El uso del exón 9 como objetivo eliminó completamente la producción de la enzima. Estos progenitores modificados fueron diferenciados hacia linaje eritroide, demostrando finalmente un descenso de la actividad PK tras la edición del genoma y su capacidad para diferenciarse hasta los estadios más maduros. Estas propiedades hacen de estas células un modelo humano novedoso y útil en el que probar nuevas terapias para el tratamiento de PKD.