Role of fatty acid sensing mechanisms in the regulation of food intake in rainbow trout as teleost fish modelendocrine control and intracellular mechanisms involved

Resumen

La regulación de la ingesta de alimento en los peces es un proceso complejo que se lleva a cabo a través de diferentes mecanismos en el sistema nervioso central, siendo el hipotálamo el principal centro regulador (Delgado et al., 2017). Todo este proceso está acompañado de una serie de señales nerviosas originadas en sensores gastrointestinales y enviadas periféricamente hasta el sistema nervioso central, donde se integran a nivel hipotalámico para el control de la ingesta (Solomon y Martínez, 2006). Diversos tejidos periféricos como el tracto gastrointestinal, hígado, páncreas y el tejido adiposo participan en el control de la alimentación. El núcleo arcuato del hipotálamo juega un papel importante en la regulación de la ingesta, puesto que presenta diversas neuronas con receptores específicos para una gran variedad de señales (López et al., 2007). Este núcleo recibe múltiples señales endocrinas periféricas, siendo la GHRL, leptina e insulina las más importantes al aportar información sobre el estado nutricional y metabólico del individuo (López et al., 2007). Desde aquí se proyectan fibras nerviosas que conectan con las demás regiones, liberando neuropéptidos orexigénicos (NPY, AgRP) o anorexigénicos (CART, POMC) modulando así la ingesta de alimento (Blouet y Schwartz, 2000; Schwartz et al., 2010). En los peces, existen varios mecanismos en las áreas del cerebro, especialmente el hipotálamo y el cerebro posterior, que detectan cambios en los niveles de nutrientes como la glucosa, los aminoácidos y los ácidos grasos (Delgado et al., 2017; Soengas et al., 2018). Estudios recientes realizados en peces demostraron la capacidad de detección de cambios en los niveles de ácidos grasos específicos a través de mecanismos de detección de ácidos grasos basados en CPT-1, la translocasa de ácidos grasos, la capacidad mitocondrial para producir ROS que inhibe el canal K+ATP y la actividad LPL (Conde-Sieira y Soengas, 2017; Soengas et al., 2018). Estos mecanismos son, en general, comparables a los descritos en mamíferos, con la excepción de la capacidad de los sistemas de peces para detectar no sólo cambios en los niveles de ácidos grasos de cadena larga sino también, de ácidos grasos de cadena media como el octanoato y de ácidos grasos poliinsaturados como el α-linolenato (Conde-Sieira et al., 2015). La activación de estos sistemas da como resultado un aumento del potencial anorexigénico, que en última instancia conduce a una menor ingesta de alimento (Soengas, 2014; Soengas et al., 2018). Las neuronas que expresan neuropéptidos también responden, a través de la unión a receptores apropiados, al efecto de diferentes hormonas. Por lo tanto, la función de los sistemas de detección de nutrientes y su impacto en la regulación de la ingesta de alimento puede verse modulada por cambios en los niveles de hormonas como leptina, GHRL, insulina, GLP-1, CCK o PYY (Diéguez et al., 2009; Blouet y Schwartz, 2010; Morton et al., 2014). Hasta la fecha, la información disponible en peces sobre la modulación endocrina de los sistemas centrales de detección de ácidos grasos es escasa, centrada únicamente en el efecto de la insulina (Librán-Pérez et al., 2015b). Los mecanismos que vinculan la función de los sistemas de detección de ácidos grasos con los cambios en la expresión de los neuropéptidos, que en última instancia regulan la ingesta de alimento, son en su mayoría desconocidos, incluso en los mamíferos. Los cambios en la expresión de neuropéptidos pueden estar relacionados con la modulación de los factores de transcripción FoxO1, CREB y BSX (López et al., 2007; Diéguez et al., 2011). Sin embargo, no está claro cómo estos factores de transcripción se relacionan con la actividad de los diferentes sistemas de detección de nutrientes. En mamíferos se han sugerido varias posibilidades que incluyen la acción directa de malonil-CoA o CPT-1, acción indirecta a través de inhibición de CPT-1, modulación por AMPK, mTOR, Akt, ChREBP o la participación de ceramidas (López et al., 2007; Diéguez et al., 2011; Gao et al., 2013; Morton et al., 2014). En base a lo mencionado anteriormente, en la presente Tesis Doctoral se ha determinado como objetivo general profundizar en el conocimiento de la regulación de los mecanismos sensores de ácidos grasos y su implicación en la modulación de la ingesta de alimento, utilizando la trucha arco iris como modelo de pez teleósteo. Para abordar este objetivo principal, se han establecido los siguientes objetivos específicos: • Caracterizar a nivel central el posible efecto modulador de la GHRL sobre la capacidad sensora de ácidos grasos, la producción de neuropéptidos y la regulación de la ingesta de alimento. Trabajo experimental Nº 1: “La GHRL modula la actividad sensora de ácidos grasos a nivel hipotalámico y modula la ingesta de alimento en trucha arcoíris”. • Estudio del efecto modulador de la GHRL sobre los sistemas sensores de ácidos grasos a nivel periférico (hígado) tras la administración central de GHRL y oleato. Trabajo experimental Nº 2: “El tratamiento intracerebroventricular con GHRL afecta al metabolismo lipídico en el hígado de la trucha arcoíris”. • Caracterización a nivel central del posible efecto modulador del neuropéptido YY sobre la actividad sensora de los ácidos grasos, la producción de neuropéptidos y la regulación de la ingesta de alimento. Trabajo experimental Nº 3: “El efecto anorexigénico del tratamiento central con PYY1-36 en la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) se asocia con cambios en los mRNAs que codifican neuropéptidos y parámetros relacionados con la detección y el metabolismo de los ácidos grasos”. • Determinar a nivel central la posible presencia de parámetros relacionados con la integración de la información metabólica proporcionada por los sistemas sensores de nutrientes, al igual que la posible implicación de vías de señalización intracelular. Trabajo experimental Nº 4: “Mecanismos hipotalámicos que integran la detección de ácidos grasos y la regulación de la ingesta de alimento en la trucha arcoíris”. • Determinar a nivel periférico la presencia de parámetros relacionados con la integración de la información metabólica proporcionada por los sistemas sensores de nutrientes, al igual que la posible implicación de vías de señalización intracelular. Trabajo experimental Nº 5: “La presencia de oleato u octanoato modifica el estado de fosforilación de Akt, AMPK, mTOR, CREB y FoxO1 en el hígado de la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)”. • Caracterización a nivel central del posible papel de las ceramidas como intermediarias entre la respuesta de los sistemas sensores de ácidos grasos y la expresión de los neuropéptidos orexigénicos y anorexigénicos que regulan la ingesta de alimento. Trabajo experimental Nº 5: “Las ceramidas están involucradas en la regulación de la ingesta de alimetno en la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)”. • Evaluar el posible papel de las ceramidas en la modulación de los efectos orexigénicos de la GHRL a nivel central. Trabajo experimental Nº 6: “Las ceramidas contrarrestan el efecto de la GHRL en el control metabólico de la ingesta de alimento en trucha arcoíris”. MODULACIÓN ENDOCRINA DE LOS SISTEMAS SENSORES DE ÁCIDOS GRASOS Y LA INGESTA DE ALIMENTO A NIVEL CENTRAL Las neuronas hipotalámicas que producen neuropéptidos que controlan la ingesta de alimento en respuesta a cambios en los niveles de nutrientes también responden, mediante la unión a receptores apropiados, al efecto de hormonas (Levin et al., 2004; Blouet y Schwartz, 2010). Estos hormonas transmiten información relativa a las reservas metabólicas y el estado energético del individuo así como de la presencia/ ausencia de alimento en el tracto gastrointestinal y su composición. La GHRL es una de las hormonas gastrointestinales involucradas en la regulación de la ingesta de alimento. El efecto orexigénico de este péptido está mediado por cambios en el metabolismo de los ácidos grasos y otros parámetros relacionados con los sistemas de detección de ácidos grasos que básicamente revierten los provocados por los niveles elevados de ácidos grasos de cadena larga como el oleato (López et al., 2008; Sangiao-Alvarellos et al., 2010; Stark et al., 2015). Por lo tanto, en el Trabajo Experimental Nº 1, hipotetizamos que en peces la respuesta a los niveles elevados de ácidos grasos de la ingesta de alimento, los mecanismos hipotalámicos de detección de ácidos grasos y la expresión de neuropéptidos podrían contrarrestarse mediante el tratamiento con GHRL. La administración central de GHRL aumenta la ingesta 24 y 48 horas después del tratamiento. Este aumento en la ingesta de alimento ocurre en paralelo con una disminución en los niveles de expresión de los péptidos anorexigénicos POMC y CART, y un aumento en los niveles de expresión de los péptidos orexigénicos AgRP y NPY, indicativos también de una respuesta orexigénica en concordancia con los cambios observados en la ingesta de alimento. Estos cambios coinciden con los observados previamente en mamíferos, donde la administración central de GHRL resultó en un aumento significativo de la expresión de NPY y AgRP (Sangiao-Alvarellos et al., 2010; Stark et al., 2015) y, ocasionalmente, en una disminución de los niveles de POMC y CART (Velásquez et al., 2011). Esta acción orexigénica se asocia con cambios en el metabolismo de los ácidos grasos y la inhibición de los sistemas de detección de ácidos grasos en el hipotálamo. Estos cambios proporcionan evidencias, por primera vez en peces, de un posible papel modulador de GHRL en la regulación metabólica de la ingesta de alimento a nivel central. En mamíferos, la hormona gastrointestinal PYY también participa en la regulación del peso corporal, no solo a través de la modulación de la ingesta de alimento, sino también mediante el control del gasto energético y el metabolismo lipídico (Guo et al., 2006). Por lo tanto, en el Trabajo Experimental Nº3, planteamos la hipótesis de que este péptido está involucrado en la regulación metabólica de la ingesta de alimento en peces. El claro efecto anorexigénico observado el trucha arcoíris tras la administración central de PYY1-36 coincide con la información obtenida hasta el momento en peces (Gonzalez y Unniappan, 2016). Este efecto anorexigénico parece ser una característica específica de los peces, ya que en mamíferos los estudios realizados muestran un efecto orexigénico de PYY1-36 (Hagan y Moss, 1995; Kanatani et al., 2000). Esta acción anorexigénica concuerda con cambios observados en la expresión de los neuropéptidos. Del mismo modo, el tratamiento central con PYY1-36 desencadena cambios en los mecanismos sensores de ácidos grasos. Por lo tanto, podemos afirmar que el efecto de PYY1-36 sobre la expresión de los neuropéptidos implicados en la regulación de la ingesta de alimento, podría estar asociado con la modulación de los mecanismos sensores de ácidos grasos. Modulación endocrina de los mecanismos de detección de ácidos grasos a nivel periférico La detección de ácidos grasos a nivel central también se asocia con cambios en el metabolismo lipídico periférico ya que el tratamiento ICV con oleato resulta en un menor potencial lipogénico y una mayor capacidad de oxidación mitocondrial en el hígado (Librán-Pérez et al., 2015c). Dado que hemos demostrado en trucha arcoíris que las acciones orexigénicas de GHRL están asociadas con cambios en el metabolismo de ácidos grasos y la inhibición de los sistemas sensores de ácidos grasos en el hipotálamo, nuestro objetivo en el Trabajo Experimental Nº 2 fue elucidar los posibles efectos del tratamiento central con GHRL en la regulación del metabolismo lipídico hepático. En este estudio demostramos, por primera vez en peces, que la GHRL también actúa a nivel central modulando el metabolismo lipídico en el hígado, aumentando el potencial lipogénico y disminuyendo el potencial de oxidación de los ácidos grasos. En general, los resultados obtenidos en hígado de trucha arcoíris son más comparables a los observados en hígado de mamíferos que los observados a nivel hipotalámico en el trabajo experimental nº 1, donde se evidenciaron algunas diferencias con el modelo de mamíferos. Por lo tanto, los sistemas sensores de ácidos grasos hipotalámicos presentes en la trucha arcoíris están involucrados en el control del metabolismo lipídico a nivel periférico (hígado) en peces. Además, la acción central de la GHRL sobre dichos sistemas respalda aún más la noción de que el hipotálamo actúa como área integradora principal en la regulación del metabolismo energético periférico en peces. INTEGRACIÓN HIPOTALÁMICA DE LA INFORMACIÓN PROCEDENTE DE LOS SISTEMAS SENSORES DE ÁCIDOS GRASOS La activación de los mecanismos de detección de ácidos grasos presentes en diferentes regiones cerebrales, resulta en un incremento en la expresión de los péptidos anorexigénicos POMC/CART y un descenso en la expresión de los péptidos orexigénicos NPY/AgRP, que finalmente conducen a un descenso en la ingesta de alimento (Soengas et al., 2018). En consecuencia, estudiamos los mecanismos que vinculan la función de los sistemas de detección de nutrientes con los cambios en la expresión de los neuropéptidos en el Trabajo Experimental Nº 4. La exposición a niveles elevados de oleato u octanoato indujo cambios comparables a los observados previamente en el hipotálamo de la misma especie en condiciones experimentales comparables (Librán-Pérez et al., 2013a), validando así el diseño experimental. Estos resultados son comparables en general a los descritos en mamíferos para oleato (Morton et al., 2014; Magnan et al., 2015) pero no para octanoato, cuyas respuestas parecen ser específicas de peces (Conde-Sieira y Soengas, 2017; Delgado et al., 2017). Observamos que la activación de los sistemas de detección de ácidos grasos en el hipotálamo por oleato u octanoato, lo que resulta en un aumento del potencial anoréxico, induce cambios en el metabolismo celular que presuntamente resultan en la activación de Akt y mTOR, y la inhibición de AMPK. Los cambios en estas proteínas se relacionarían con cambios en la expresión de los neuropéptidos a través de cambios en el estado de fosforilación de los factores de transcripción que se encontrarían bajo el control de dichas proteínas, como CREB y FoxO1. En este estudio, tras el aumento de los niveles de oleato u octanoato evidenciamos una disminución clara en el estado de fosforilación de CREB y un aumento en el estado de fosforilación de FoxO1. Además, los cambios observados en el estado de fosforilación de todas las proteínas estudiadas desaparecieron en presencia del inhibidor específico de cada proteína, dando así un mayor apoyo a la especificidad de la respuesta. Aún es necesario evaluar los mecanismos precisos involucrados en estos mecanismos, así como el papel de otros componentes no estudiados hasta el momento como BSX. Sin embargo, estos resultados proporcionan por primera vez en peces, evidencias sobre todos los pasos involucrados en la regulación hipotalámica de la ingesta de alimento, desde la detección de los niveles elevados de ácidos grasos hasta los cambios en la expresión de neuropéptidos que finalmente modulan la ingesta de alimento. INTEGRACIÓN PERIFÉRICA DE LA INFORMACIÓN PROCEDENTE DE LOS SISTEMAS SENSORES DE ÁCIDOS GRASOS En mamíferos, las proteínas involucradas en la señalización celular como Akt, mTOR y AMPK y los factores de transcripción CREB y FoxO1 podrían estar relacionados con el efecto modulador a corto plazo ejercido por los ácidos grasos en las vías metabólicas (Whiteman et al., 2002; Herzig et al., 2003; Cantó y Auwerx, 2010; Ricoult y Manning, 2013). En el trabajo experimental Nº 4 demostramos que estas proteínas están involucradas en la modulación de las rutas metabólicas lipídicas. Por lo tanto, en el Trabajo Experimental Nº 5 esperamos una respuesta tras el tratamiento con ácidos grasos en hígado, de las proteínas involucradas en la señalización celular y los factores de transcripción. En general, tanto el tratamiento con oleato como con octanoato en el hígado resultaron en un incremento en la capacidad lipogénica y una disminución de la actividad mitocondrial. Estos cambios son comparables a los observados previamente bajo condiciones experimentales similares en la misma especie (Librán-Pérez et al., 2013b), validando así nuestro diseño experimental. Bajo estos cambios en el metabolismo lipídico, evaluamos el papel de las proteínas de interés. Observamos un aumento en el estado de fosforilación de Akt. Dado que en mamíferos la activación de Akt generalmente resulta en un incremento de la capacidad lipogénica en el hígado (Whiteman et al., 2002), los resultados observados sugieren una respuesta similar en peces. La disminución observada en el estado de fosforilación de AMPK en el presente estudio concuerda con el papel de AMPK como sensor energético, ya que en situaciones de mayor disponibilidad de energía disminuye el estado de fosforilación de dicha proteína (Cantó y Auwerx, 2010). En este estudio también observamos un claro aumento en el estado de fosforilación de mTOR, resultado razonable considerando la disminución observada en los valores de AMPK ya que se sabe que esta proteína ejerce un control negativo sobre la señalización de mTOR en mamíferos (Hasenour et al., 2013). En cuanto al estado de fosforilación de los factores de transcripción, el aumento de FoxO1 y la disminución de CREB son comparables a los observados previamente en peces en condiciones similares (Craig y Moon, 2011; Zhang et al., 2016). La modificación de los niveles de fosforilación de las proteínas implicadas en la señalización intracelular y los factores de transcripción se produjo en paralelo con cambios en los niveles de mRNA de numerosos genes implicados en el metabolismo lipídico, lo que nos permite sugerir una relación entre ambos procesos. IMPLICACIÓN DE LAS CERAMIDAS EN EL CONTROL DE LA INGESTA DE ALIMENTO En mamíferos las ceramidas están involucradas en el control de la ingesta de alimento a través de mecanismos relacionados con SIRT-1 (Gao et al., 2011) y AMPK (Ramírez et al., 2013) y vías de señalización intracelular como las mediadas por Akt, mTOR y FoxO1 (Bikman y Summers, 2011; Lipina et al., 2014). Dado que previamente demostramos (trabajos experimentales nº 4 y 5) la relación directa entre los cambios en estas proteínas y la modulación de la ingesta de alimento, hipotetizamos que las ceramidas también están involucradas en la regulación de la ingesta de alimento en peces, a través de la modulación de los sistemas sensores de ácidos grasos, los sensores energéticos y las vías de señalización intracelular (Trabajo Experimental Nº 6). La administración central de ceramidas, desencadenó una clara disminución en la ingesta de alimento, la cual se puede atribuir a los cambios observados en la abundancia de mRNA de los neuropéptidos anorexigénicos (aumento de POMC-A1 y CART) y los orexigénicos (disminución de AgRP y NPY), indicativos de un incremento del potencial anorexigénico. Esta respuesta es totalmente opuesta al efecto orexigénico descrito en mamíferos, en el que los niveles elevados de ceramidas se asocian con una mayor ingesta de alimento en algunos casos (Ramírez et al., 2013). En general los sistemas sensores de ácidos grasos parecen inactivados tras el tratamiento central con ceramidas, lo cual describe una situación comparable a la que se observa en mamíferos. Sin embargo, el hecho de que los cambios en la ingesta de alimento y la expresión de neuropéptidos provocados por el tratamiento con ceramidas (respuesta anoréxica) fueran similares a los provocados en la misma especie cuando se trataron con ácidos grasos (Librán-Pérez et al., 2012, 2014) sugiere que la acción de las ceramidas sobre la ingesta de alimento se produce a través de mecanismos distintos de la detección de ácidos grasos, como los sensores integradores y las vías de señalización celular. En conjunto las vías de señalización intracelular evaluadas en el hipotálamo y el cerebro posterior de la trucha arcoíris se activan mediante el tratamiento con ceramidas de una manera comparable a la descrita en mamíferos, con la notable excepción de Akt, que se comporta de forma opuesta. Sin embargo, existen diferencias en la respuesta del estado de fosforilación de AMPK, mTOR y FoxO1 entre el hipotálamo y el cerebro posterior. La activación observada en estas vías es comparable a la observada previamente en el hipotálamo de la misma especie cuando se alimenta con una dieta rica en lípidos (Librán-Pérez et al., 2015a), lo que presumiblemente también resulta en niveles elevados de ceramidas en el cerebro. Sin embargo, cabe destacar que todos estos cambios en las vías de señalización celular después del tratamiento con ceramidas ocurren al mismo tiempo que se observa una disminución en la ingesta de alimento. Esta diferencia puede relacionarse con las diferentes respuestas observadas en el hipotálamo y el cerebro posterior, en el estado de fosforilación de AMPK (disminución en hipotálamo y aumento en cerebro posterior), mTOR (disminución en hipotálamo y aumento en cerebro posterior) y FoxO1 (aumento en hipotálamo y disminución en cerebro posterior) tras el tratamiento con ceramidas. Estos resultados sugieren que las ceramidas están involucradas en la regulación de la ingesta de alimento en trucha arcoíris a través de mecanismos comparables en algunos casos a los caracterizados previamente en mamíferos. En estudios previos demostramos que la administración central de GHRL en peces aumenta la ingesta de alimento como ocurre en mamíferos (trabajo experimental nº 1). Del mismo modo, demostramos que la administración central de ceramidas disminuye la ingesta de alimento (trabajo experimental nº 6), pero en este caso de forma opuesta a la descrita en mamíferos. Teniendo en cuenta que en mamíferos las ceramidas están involucradas en la modulación de los efectos orexigénicos de la GHRL (Ramírez et al., 2013), planteamos la hipótesis de que la posible interacción entre GHRL y ceramidas debe ser diferente en peces y tratamos de clarificar esta posibilidad con el Trabajo Experimental Nº 7. Dichas diferencias podrían surgir de una posible característica específica de las ceramidas en peces ya que, en general, los efectos de la GHRL son más comparables a los descritos en mamíferos, mientras que los de las ceramidas son bastante diferentes. La profundización del estudio de estos mecanismos diferenciales probablemente resultará en un mejor conocimiento de la regulación de la ingesta de alimento en peces, con la consiguiente mejora de las prácticas de alimentación en la acuicultura. En general, los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral han servido para profundizar en el conocimiento sobre el funcionamiento de los sistemas sensores de ácidos grasos y la modulación de la ingesta de alimento, proporcionando asimismo evidencias sobre la acción moduladora de algunas hormonas gastrointestinales sobre dichos sistemas tanto a nivel central como periférico. Asimismo, hemos obtenido por primera vez en peces, evidencias sobre todos los pasos involucrados en la regulación de la ingesta de alimento, desde la detección de cambios en los niveles de ácidos grasos hasta la modulación de la expresión de neuropéptidos que finalmente conducen a la regulación de la ingesta de alimento. En este sentido, los resultados obtenidos demostraron el papel de algunas proteínas involucradas en las vías de señalización intracelular como posibles mecanismos de integración a través de los cuales los cambios en la actividad de los sistemas de sensores se traducen en cambios en la expresión de neuropéptidos que controlan la ingesta. Finalmente, estos resultados demostraron el papel de las ceramidas en la regulación de la ingesta de alimento, sugiriendo una acción sobre los sistemas integradores y las vías de señalización celular. Los resultados obtenidos ayudan a esclarecer el complejo marco metabólico y endocrino que regula la ingesta de alimento en peces, siendo de gran importancia ya que una mejor comprensión de los mecanismos implicados en la regulación de la ingesta ayudará a optimizar el consumo de alimento y, en definitiva el crecimiento, principal preocupación de la actividad acuícola.