Caracterización de las interacciones de la fasina PhaF en la bacteria modelo acumuladora de polihidroxialcanoatos, Pseudomonas putida KT2440

Resumen

El descubrimiento de los polihidroxialcanoatos (PHA) en el citoplasma de Bacillus megaterium por Lemoigne en 1926, desveló la existencia de nueva una clase de polímeros con propiedades modulables y su posible aplicación como bioplásticos. Esto fomentó el estudio de las proteínas involucradas en su síntesis como las fasinas. El interés en estas proteínas surgió por dos motivos: i) las fasinas forman una capa proteica en la superficie de los gránulos de PHA; y ii) son producidas en altas concentraciones por las células que acumulan PHA. Poco después, se descubrió que su producción es dependiente directamente de la síntesis de PHA, y que desempeñan un papel importante en la estabilización física de los gránulos de PHA, el control del su número y tamaño, en la segregación de los mismos durante la división celular y en su posterior degradación. De forma general, las fasinas suelen estar compuestas por alfa helices anfipáticas y regiones de oligomerización de tipo coiled coil que podrían participar en su interacción con otras proteínas. En esta Tesis doctoral, se caracterizaron los dominios coiled coil de las fasinas PhaF y PhaI (ZIP), producidas por la bacteria Pseudomonas putida KT2440. La oligomerización de estas proteínas se confirmó mediante interferometría de biocapa y el sistema de doble híbrido in vivo (BACTH), determinándose que mutaciones puntuales en residuos clave (leucinas o valinas) ubicados dentro del núcleo hidrofóbico de estos ZIP, causan la desestabilización o disociación de los complejos entre PhaF y PhaI. Estos resultados demostraron que los motivos ZIP son los responsables de la oligomerización de las fasinas. Teniendo en cuenta el impacto de las fasinas, principalmente PhaF, en la fisiología celular y en la expresión de los genes pha, en este trabajo se utilizó un enfoque holístico para identificar proteínas de P. putida KT2440 que podrían establecer interacciones con PhaF. Mediante un sistema de cromatografía de afinidad acoplado a espectrometría de masas, se identificaron 6 proteínas, incluidas la fasina PhaI y PhaD (regulador transcripcional). PhaD es un activador de la trascripción de los genes pha que se une a regiones en los promotores PC1 y PI del conjunto génico pha. La interacción entre PhaF y PhaD se detectó mediante ensayos de BACTH. Estudios de desplazamiento de movilidad electroforética usando el promotor PI revelaron la formación de un complejo (ADN, PhaD y PhaF) con una migración diferente a las del complejo PI con cada una de las proteínas por separado. Además, la ausencia de PhaD en los gránulos de PHA, corroborada mediante ensayos de localización in vivo con GFP, sugirió la existencia de un nuevo mecanismo en el que el complejo formado por PhaD y PhaF podría estar participando en el sistema regulador que controla la expresión del conjunto génico pha. Finalmente, se caracterizó la robustez y la estabilidad de PhaF en diferentes interfaces y su adsorción al PHA, para estudiar su potencial en el desarrollo de nuevas aplicaciones en biotecnología y biomedicina, incluyendo la funcionalización de la superficie de biomateriales hidrofóbicos. Con la técnica de Langmuir y métodos espectroscópicos se determinó que la adsorción de PhaF en monocapas de PHA da lugar a la formación de films mixtos, estables por debajo de una presión superficial de 15.7 mN por m. Se demostró que poliésteres más hidrofóbicos, son sustratos más apropiados para la funcionalización mediada por PhaF. Esta técnica permitió la formación de films de PhaF, estables y robustos a diferentes temperaturas, con una orientación de su alfa hélice que garantiza un contacto óptimo de los residuos hidrófobos de la proteína con interfaces hidrofóbicas. Estos films se transfirieron con éxito a sustratos sólidos, aportando una estrategia de recubrimiento adecuada para producir materiales funcionalizados.