Análisis de la heterogeneidad del reciclamiento vesicular y mecanismos implicados en su regulaciónestudio en un modelo de X-frágil

Resumen

La neurotransmisión se basa en el establecimiento de contactos neuronales o sinapsis, que traducen señales eléctricas en señales químicas y viceversa. Este proceso acontece al liberarse los neurotransmisores almacenados en vesículas sinápticas (VSs) desde una neurona presináptica y ser reconocidos por receptores específicos en la neurona postsináptica. En este proceso, las VSs son transferidas a la zona activa (ZA), donde son ancladas (docked) y sometidas a un proceso de maduración funcional (priming) que las hace competentes para la exocitosis cuando llega un potencial de acción. Finalizada la exocitosis, las VSs son recicladas mediante diferentes mecanismos de endocitosis que las permiten volver a estar disponibles para su liberación. Este proceso se conoce como ciclo vesicular (CV). El citoesqueleto de actina participa activamente en todas las etapas del CV, movilizando las VSs a la ZA y regulando tanto la exocitosis como la endocitosis. La contribución de los diferentes mecanismos de reciclamiento varía entre sinapsis dependiendo de las condiciones de estimulación y de los distintos estadios de maduración de las sinapsis, constatándose que la endocitosis masiva (EM), dependiente de los complejos adaptadores AP1/AP3 es mayoritaria en estadios más inmaduros. En este trabajo, hemos combinando técnicas de imagen en célula viva e inmunofluorescencia con análisis de microscopía electrónica para estudiar diferentes procesos del CV relacionados con la eficacia de reciclamiento en neuronas granulares de cerebelo de rata y corticales de cerebro de ratón, tanto de genotipo silvestre (WT) como en un modelo de sinapsis defectuosa (Fmr1 KO). En neuronas granulares de cerebelo, hemos encontrado que los botones de menor eficacia de reciclamiento, caracterizados por una mayor contribución de la EM durante el reciclamiento vesicular, dependen en mayor medida de AP1/AP3 para la regeneración de VSs a partir de los endosomas formados, siendo totalmente dependiente de dichos complejos en una subpoblación de terminales. A su vez, la dinámica del citoesqueleto de actina es determinante en la exocitosis, permitiendo el reclutamiento de VSs en las inmediaciones de la ZA. Los resultados encontrados muestran que el proceso más afectado en los botones de mayor eficacia de reciclamiento es la exocitosis, si bien la tensión mecánica ejercida por los filamentos de actina es necesaria en todas las formas de endocitosis, afectando a ambas poblaciones de botones. En neuronas corticales de cerebro observamos que la disrupción del citoesqueleto de actina no altera la ultraestructura presináptica de neuronas WT ni Fmr1 KO en reposo. Sin embargo, en células Fmr1 KO, la despolimerización de actina previo a una estimulación intensa disminuye el número de VSs recicladas y acelera la exocitosis de acuerdo con la disfunción en la polimerización de actina descrita en el síndrome del X-Frágil (SXF). Por otra parte hemos demostrado que los estímulos breves promueven la liberación de una mayor proporción de VSs recicladas en neuronas Fmr1 KO sin afectarse el tamaño del pool de reciclamiento. Este resultado sugiere un aumento del tamaño del RRP (por sus siglas en inglés, Readily Releasable Pool) en las neuronas Fmr1 KO, que fue confirmado mediante microscopía electrónica, observándose además mayor densidad de VSs en este genotipo. En secciones de corteza somatosensorial de ratón Fmr1 KO se constató un aumento de la densidad de sinapsis excitatorias asociadas a una reducción de la superficie postsináptica, siendo este hecho un rasgo fisiológico característico del SXF. Además se confirmó el mayor número de VSs docked, siendo éstas el correlato ultraestructural del RRP. A su vez, una estimulación intensa propició una mayor acumulación de endosomas en terminales WT, evidenciando la mayor contribución de la EM en este genotipo. En su conjunto, los resultados encontrados en neuronas corticales sugieren que el reciclamiento vesicular es más eficiente en el genotipo Fmr1 KO.