Caracterización y producción de β-NGF y su papel en la fisiología reproductiva del conejo

  1. Sanchez Rodriguez, Ana
Dirigida por:
  1. Rosa M. García García Directora
  2. Pedro Luis Lorenzo González Director

Universidad de defensa: Universidad Complutense de Madrid

Fecha de defensa: 05 de diciembre de 2018

Tribunal:
  1. Amalia Diez Martín Presidenta
  2. Consuelo Serres Dalmau Secretaria
  3. María Antonia Gil Corbalán Vocal
  4. Manuel Avilés Sánchez Vocal
  5. Manel López Béjar Vocal
Departamento:
  1. Fisiología

Tipo: Tesis

Resumen

El factor de crecimiento nervioso beta (bNGF)es una neurotrofina presente en el sistema reproductor de muchas especies animales e interviene en importantes funciones como la espermatogénesis, foliculogénesis, maduración de gametos y ovulación. Es el factor inductor de la ovulación en especies de ovulación inducida, como los camélidos. En conejos adultos, el bNGF y sus dos receptores (sistema bNGF) se encuentran en órganos masculinos (testículos, próstata, glándulas seminales) y femeninos (ovarios, oviducto, útero, cérvix), pero no se ha caracterizado durante el desarrollo sexual ni se conoce su relación con hormonas como la testosterona. Aunque el conejo es una especie de ovulación inducida, no se ha demostrado si el bNGF provoca la ovulación como en camélidos ya que no se ha obtenido una respuesta ovulatoria adecuada con plasma seminal (PS) homólogo ni heterólogo, ni con bNGF de origen murino. Los objetivos de la presente tesis doctoral fueron 1) caracterizar el sistema bNGF en el tracto reproductor del conejo durante el periodo de la madurez sexual, así como su relación con la testosterona, 2) producir bNGF recombinante biológicamente funcional a partir de la próstata del conejo estudiando la secuencia proteica con respecto a otras especies, y 3) realizar estudios in vitro para valorar la respuesta en los espermatozoides e in vivo para determinar los efectos en la respuesta ovulatoria de las conejas inseminadas con bNGF recombinante.Se realizaron experimentos de expresión génica e inmunohistoquímica en próstata, glándulas bulbouretrales y epidídimo de conejos durante la madurez sexual. Se observó una expresión constante de cada gen en los tejidos durante el periodo analizado, aunque el bNGF apareció en mayor cantidad en próstata frente al resto de tejidos. La imnunolocalización varió entre tejidos y aparecieron diferencias en la distribución según la edad del animal.La producción de bNGF recombinante se realizó tras la secuenciación a partir de la próstata de conejo (KX528686) y la inserción en un plásmido, el cual se transfectó en células CHO; su secuencia proteica se comprobó mediante huella peptídica. Se testó en células PC12, en las cuales produjo la diferenciación a células tipo neurona, y se determinaron los efectos sobre espermatozoides de conejo, que mantuvieron su calidad espermática. La comparación de la secuencia proteica del bNGF recombinante de conejo con otras especies mostró cambios en residuos específicos de unión a los receptores TrkA y p75, que podrían explicar particularidades de la reproducción de esta especie. En el estudio in vivo con el bNGF recombinante incluido en la dosis de inseminación, las dosis más altas testadas (20 y 100 microgramos por ml) disminuyeron los parámetros seminales. La administración por vía intravaginal de bNGF recombinante en conejas desencadenó la ovulación de manera dosis dependiente, siendo 1 microgramo por ml la dosis con mayor tasa de ovulación (60 por ciento).Se observó un efecto luteotrópico y folículoestimulante dependiente también de la dosis de bNGF. Aparecieron vesículas embrionarias en la mayoría de conejas ovuladas. Las conclusiones de esta tesis doctoral indican que el sistema bNGF se expresa de manera constante durante la madurez sexual en el tracto reproductor del conejo y presenta una inmunolocalización variable dependiendo del órgano y de la edad del animal. Además, la concentración de bNGF en PS y plasma sanguíneo es independiente de la testosterona. El bNGF recombinante producido es funcional en células PC12 y mantiene la calidad espermática en el semen de conejo. Su secuencia de aminoácidos difiere con la de otras especies, lo que sugiere que estos cambios tienen cierta relevancia en la fisiología reproductiva del conejo. Por último, el bNGF recombinante adicionado en la dosis seminal induce la ovulación en conejas por vía intravaginal con una respuesta dependiente de la dosis y manteniendo el estatus fisiológico durante el desarrollo embrionario temprano.