Caracterización imunoproteómica de derivados proteicos de "Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium (subespecies avium y paratuberculosis) y Corinebacterium pseudotuberculosis"aplicación diagnóstica

Zusammenfassung

La tuberculosis animal es una zoonosis bacteriana producida por bacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis, especialmente M. bovis y M. caprae que representa un importante problema sanitario en el hombre y los animales. Por esta razón, en la Unión Europea, los bovinos están sometidos a un programa de erradicación que se basa en el diagnóstico y sacrificio de los animales reaccionantes a las pruebas de diagnóstico oficiales, cuyo reactivo básico es la tuberculina bovina o PPDb. Esta es un derivado proteico purificado de M. bovis de composición y titulación compleja. Por todo ello nos planteamos el estudio de este reactivo, para a través del conocimiento de la composición de las tuberculinas poder mejorar el diagnóstico. En primer lugar, llevamos a cabo una caracterización inmunoproteómica utilizando anticuerpos monoclonales que nos han permitido identificar cinco proteínas inmunodominantes en la PPDb: MPB70, MPB83, HspX y ESAT-6, exclusivas del MTBC, y meromycolate acyl carrier protein presente también en la PPDa. Las cuatro primeras forman parte de un complejo multiproteico, que se obtiene siempre por inmunopurificación, a partir de la PPDb con el AcM SIM 377-18 que reconoce un epítopo común en las proteínas MPB70 y MPB83. A este complejo multiproteico lo denominamos P22. Los resultados obtenidos indican que cuando los ratones son inoculados con la PPDb se detecta casi exclusivamente una respuesta serológica de alta intensidad frente a MPB70/83. Esta exclusividad en la respuesta, podría ser debida a su superior concentración en el complejo y a su orientación y posible estructura micelar, que vería favorecido su procesamiento por el sistema inmunitario. En segundo lugar, para abordar los problemas relacionados con la especificidad, procedimos al estudio de las proteínas compartidas entre M. bovis, M. avium avium, M. avium paratuberculosis y C. pseudotuberculosis, mediante la utilización de AcM obtenidos con las bacterias mencionadas. Obtuvimos un total de 21 AcM que reconocen las proteínas comunes: ModD protein, PPE family protein, Serine protease, Meromycolate acyl carrier protein, Diacylglicerol acyltransferase, GroEL y Enolasa. Paralelamente a los estudios mencionados y con el objetivo de hacer una aproximación teórica de las proteínas responsables de la reactividad cruzada entre la PPDb, PPDa y P22, se llevó a cabo un análisis mediante espectrometría de masas. Este estudió nos permitió identificar las proteínas constituyentes de las tres preparaciones, así como las proteínas compartidas entre ellas, calcular su concentración, calcular la antigenicidad en una respuesta humoral y proponer P22 para ser utilizado en ensayos tipo ELISA en la detención de anticuerpos específicos frente a bacterias del MTBC. Desarrollamos y evaluamos nuevos ensayos multiespecie para el diagnóstico ante-morten y post-morten de la tuberculosis en animales. Como resultados más notables de estos ensayos, hemos comprobado que uno de los anticuerpos, el SIM 377-18, ha mostrado un gran potencial para estudios inmunohistoquímicos en cortes de tejidos procedentes de animales tuberculosos y que P22 es más sensible para la detección de anticuerpos frente a M. bovis y M. caprae que las proteínas recombinantes MPB70 y MPB83. Por último, hemos descrito el desarrollo y la validación de un ELISA indirecto basado en el complejo proteico P22 para utilizar en el diagnóstico de tuberculosis en distintas especies domésticas y salvajes. Debido a su excelente especificidad en cerdos y camélidos y una especificidad aceptable en ganado bovino, ovejas y tejones, este ELISA puede constituir una buena opción para el diagnóstico de la tuberculosis a nivel de rebaño. Además, se propone el diagnóstico serológico como técnica de vigilancia para detectar anticuerpos específicos frente MTBC, sobre todo en países oficialmente libres de tuberculosis y en animales no sometidos a la prueba de IDTB debido a su alta especificidad en estas condiciones y sus ventajas.