Tipificación y análisis genómico de la resistencia a azoles en Aspergillus fumigatus

Resumen

Aspergillus fumigatus es un hongo filamentoso saprófito que habita en numerosos nichos ecológicos y generalmente en el suelo enriquecido con material orgánico. Como forma de dispersión, libera un gran número de esporas al aire. Los individuos inmunocomprometidos no son capaces de deshacerse de ellas, colonizando el tejido pulmonar y produciendo enfermedad invasiva que en muchos casos deriva en diseminación hematógena. A. fumigatus es el principal agente causal de un grupo de patologías conocidas generalmente como aspergilosis. Dentro de todas ellas, la aspergilosis invasiva (AI) es la manifestación clínica más severa así como la más común. Como el diagnóstico precoz es difícil y el tratamiento complejo se puede entender que los antifúngicos se utilicen a la menor sospecha de infección. Así, el protocolo de tratamiento de la enfermedad base incluye la profilaxis con antifúngicos. Esta situación ha facilitado el desarrollo de resistencias secundarias a los fármacos más empleados, los azoles. En la actualidad, el desarrollo de mecanismos de resistencia secundarios al tratamiento con azoles es un hecho ampliamente constatado y en claro aumento ya que su uso sigue creciendo no solo en el ámbito hospitalario sino también en otros sectores. Por ejemplo, los azoles se emplean en el campo como fungicidas para tratar los cultivos antes, durante y después de la cosecha, lo que favorece el desarrollo de resistencias. Se considera que esta ruta tiene carácter ambiental y los aislados de A. fumigatus que derivan de ella presentan una clase de mecanismos de resistencia a los azoles diferentes que los que se describen en las cepas resistentes aisladas de pacientes infectados y tratados con azoles. Los primeros poseen integraciones de repeticiones en tándem (TR) de un número variable de pares de bases en el promotor del gen cyp51A a veces en combinación con modificaciones puntuales en el propio gen (TR34/L98H, TR46/Y121F/T289A y TR53), mientras que las cepas resistentes de la ruta clínica solo contienen modificaciones puntuales en el gen cyp51A (G54, G138, P216, M220 y G448). La resistencia a los compuestos azólicos es un problema en aumento que se agrava con la existencia de resistencia cruzada dentro de esta familia de antifúngicos. Además, se ha descrito que los pacientes que se enfrentan a infecciones invasivas causadas por cepas de A. fumigatus resistentes a los azoles tienen más riesgo de sufrir fallo terapéutico. En este contexto, en esta Tesis se desarrollaron varias aproximaciones experimentales tratando de profundizar en el conocimiento de este importante patógeno. En primer lugar, se desarrolló y estandarizó un método de tipificación molecular (TRESPERG) para diferenciar entre cepas de A. fumigatus y genotiparlas usando cuatro marcadores que presentan regiones con secuencias codificantes repetidas. En segundo lugar, se comparó este método de tipificación con el ensayo de referencia para tipificar A. fumigatus (STRAf) y se determinó que ambos métodos discriminaban los aislados de una manera eficaz. Sin embargo, el método TRESPERG es capaz de resolver mejor las relaciones entre los aislados según sus mecanismos de resistencia a azoles. Además, se estudiaron dos subpoblaciones de A. fumigatus portadoras de una serie de polimorfismos en el gen cyp51A (F46Y, M172V y D255E o F46Y, M172V, N248T, D255E y E427K) por sus características fenotípicas especiales en cuanto a su perfil de sensibilidad variable a los azoles. Se concluyó que las modificaciones en la diana de los azoles no son completamente responsables de su fenotipo sino que el fondo genético de estos aislados tiene un papel mucho más destacable. Por último, se utilizó una aproximación genómica para tratar de caracterizar cepas sensibles y resistentes a azoles portadoras de distintos mecanismos de resistencia. Se concluyó que todos los genomas incluidos en este trabajo se organizan en cuatro linajes con características genotípicas y fenotípicas muy diferentes.