Modelado integrativo de la estructura 3d de macromoléculas. /intregrative modeling of the 3d structure of macromolecules

Résumé

El estudio de la estructura de las biomoléculas es fundamental para entender la vida desde un punto de vista molecular. Los métodos directos usados para resolver la estructura de complejos macromoleculares, como la cristalografía de rayos X, están llegando a su límite y el futuro se está abriendo paso para resolver dichas estructuras mediante la integración de datos provenientes de distintas técnicas. El objetivo de esta Tesis ha sido desarrollar métodos integrativos para resolver estructuras de complejos macromoleculares. Se han desarrollado dos métodos, uno dirigido a determinar la conformación de complejos multiproteicos y otro para inferir la estructura de la cromatina de distintas regiones del genoma. El primer método se utilizó para resolver la arquitectura del exocyst, un complejo multiproteico compuesto por 8 proteínas, responsable de fusionar vesículas secretoras a la membrana plasmática. El exocyst ha sido difícil de purificar hasta ahora, y, por ello, ha sido difícil resolver su estructura atómica mediante técnicas convencionales. El método combina la información estructural de cada subunidad con las distancias entre ellas obtenidas mediante microscopía óptica. Estas distancias, medidas entre distintos fluoróforos fusionados a los extremos amino y carboxilo terminal de cada subunidad, se usan como restricciones espaciales para resolver la estructura. Nuestra herramienta, gracias a algoritmos optimizadores, genera modelos tridimensionales (3D) del exocyst que cumplen las restricciones impuestas. Mediante el análisis de la población de los mejores modelos, se propuso un modelo representativo. Nuestros resultados demuestran que la integración de múltiples datos ayuda a resolver estructuras de complejos multiproteicos y podría usarse en dichos casos donde las técnicas convencionales no son eficientes. Pero no solo la estructura de las proteínas y complejos proteicos es importante, sino que, recientemente, se ha visto que la estructura juega un papel crítico en la cromatina y está relacionada con la expresión génica. A su vez, la estructura es importante para estudiar sus funciones, su implicación en enfermedades e inferir información evolutiva. En este caso se ha utilizado una aproximación similar a la utilizada en el exocyst, mediante datos de 4C-seq (Circular chromosome conformation capture). Se desarrolló una herramienta para predecir la conformación 3D de la cromatina de distintos loci genómicos. Para ello, se representó la cromatina como una concatenación flexible de esferas y se calculó la localización de estas esferas en el espacio 3D gracias a distancias obtenidas mediante 4C-seq, técnica que calcula la frecuencia de interacciones entre distintos fragmentos de ADN. La posición de las esferas se calcula integrando todas las distancias entre estas esferas, como restricciones espaciales. Después, estas restricciones se optimizan y se extraen los modelos 3D que cumplen la mayoría de las restricciones. El método ha sido aplicado para inferir la estructrura de la cromatina de las regiones Hox y Six en diversas especies y para estudiar regiones que han sufrido variaciones estructurales. Esta herramienta está disponible para la comunidad científica y se ha demostrado que genera modelos 3D de confianza. Es capaz de generar mapas de contacto, similares a los generados mediante Hi-C (Chromosome conformation capture aplicado a todo el genoma) derivados de los modelos 3D (Hi-C virtuales), que pueden ser usados para comparar estructuras entre diferente regiones o especies. Además, esta herramienta es útil a la hora de predecir estructuras 3D de regiones genómicas con variaciones estructurales o incluso cuando no se dispone del mapa de contacto Hi-C de una especie en particular. Todo este trabajo demuestra que los métodos integrativos no son una alternativa si no un apoyo de gran utilidad cuando los experimentos convencionales no son eficientes.