Definición de biomarcadores discriminatorios de fenotipos clinicos en enfermedades respiratorias complejasasma y alergia

Resumen

El asma y la alergia son enfermedades respiratorias crónicas que poseen un amplio espectro clínico, resultado de múltiples interacciones entre factores génicos y medioambientales. Los mecanismos alérgicos se ha demostrado que están implicados en un 50-80 % de los casos asmáticos, y en aproximadamente un 50 % de los pacientes con asma grave. Los mecanismos del asma son complejos y se caracterizan por la inflamación de las vías respiratorias. La activación de células T cooperadoras de tipo 2 (Th2) específicas de alérgeno y de células linfoides innatas de tipo 2 son las responsables de la inflamación eosinofílica (o asma Th2-alta). Sin embargo, otras células importantes, las células Th17, originan el reclutamiento de neutrófilos (asma Th2-baja). La clasificación del asma aún no está clara y la descripción de endotipos bien definidos es necesaria mediante el uso de biomarcadores. Actualmente no hay biomarcadores específicos de asma mediada por una respuesta Th2-baja, por lo que su búsqueda es una necesidad real en clínica. El objetivo de esta Tesis fue analizar el potencial de 94 biomarcadores moleculares y definir su capacidad de discriminación entre las enfermedades asmáticas y alérgicas en muestras derivadas de sangre, en una población bien definida clínicamente, además de su relación con la gravedad de la enfermedad. La expresión de 94 genes, seleccionados de trabajos publicados anteriormente, se estudió en una población de 104 sujetos: 30 sujetos control (C), 30 pacientes con asma no alérgica (ANA), 30 pacientes con asma alérgica (AA) y 14 pacientes con alergia (rinitis) sin asma (AR). En los 2 grupos de pacientes con asma, un 50 % mostraron asma grave y el otro 50 %, un diagnóstico moderado-leve. Para ello, se extrajo el ARN de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de todos los sujetos, por el método del Trizol y se analizó por qRT-PCR. Para el estudio epigenético de metilación, se analizó el ADN extraído de las PBMC (por Trizol) mediante la amplificación de las islas CpG cercanas a la región del promotor de varios genes. La cuantificación de proteína se llevó a cabo utilizando las técnicas de ELISA (en suero) o de western blot (en proteína extraída de PBMC por el método Trizol) dependiendo de la naturaleza del biomarcador. La sensibilidad y especificidad de la expresión génica y proteica de varios biomarcadores candidatos para la diferenciación de los grupos de la población se realizó por el análisis de curvas ROC. La expresión de los 94 genes analizados mostró buena sensibilidad y especificidad para discriminar los diferentes grupos clínicos de estudio. El análisis de la expresión génica entre los grupos clínicos y el grupo control mostró distintos grupos de genes con diferencias estadísticamente significativas. Además, el análisis según la gravedad de la enfermedad reveló 9 genes, IL-10, MSR1, PHLDA1, SERPINB2, CHI3L1, CPA3, IL-8, IL-1R2 y PI3, asociados con los fenotipos de asma grave o moderada-leve. MSR1, PHLDA1, CHI3L1 y PI3 mostraron diferencias estadísticamente significativas en los perfiles de metilación entre pacientes con ANA y sujetos C. El análisis de expresión proteica de los genes asociados a gravedad reveló diferencias estadísticamente significativas en los niveles de algunas proteínas entre los grupos clínicos y la gravedad del asma. En el análisis por curvas ROC, cada gen individual mostró buena sensibilidad y especificidad para discriminar algunos de los fenotipos. Sin embargo, se observaron combinaciones interesantes de 2 o 3 biomarcadores proteicos para discriminar la enfermedad asmática y alérgica. Como conclusión general, se han definido paneles génicos y proteicos, compuestos por biomarcadores individuales y combinados, en muestras fáciles de obtener y por técnicas estandarizadas, que podrían ser útiles para caracterizar los distintos fenotipos de asma y alergia, pero sobre todo, para discernir distintos fenotipos clínicos entre sí, así como, la gravedad de la enfermedad asmática.