Desarrollo y validación de nuevas pruebas de campo de inmunidad celular y molecular para la detección de la infección por leishmania infantum

Resumen

El cambio climático, las migraciones masivas, las transformaciones ambientales y las condiciones de inmunodepresión han convertido a la leishmaniasis en un serio problema de salud pública. A esto hay que sumarle la falta de herramientas de control y de estrategias de eliminación. Las técnicas de diagnóstico actuales para confirmar la leishmaniasis visceral VL, monitorizar el éxito del tratamiento farmacológico o para detectar recaídas son difíciles de trasladar al campo. Además, la identificación y el manejo de sujetos asintomáticos se ha convertido en un desafío cada vez más importante en los programas de control. Por ello, el objetivo principal de esta tesis engloba la evaluación de nuevos ensayos de campo para el diagnóstico de los casos tempranos y la detección de la infección asintomática causada por L.infantum y L.donovani, así como el seguimiento tras el tratamiento de pacientes VL. El ensayo de amplificación de ácidos nucleicos en condiciones isotérmicas LAMP junto con el kit de detección de Leishmania Loopamp, se empleó en el diagnóstico de los casos activos. Los reactivos liofilizados del kit Loopamp facilitan los estudios de campo, evitando la cadena de frío. Además, el fluorímetro en tiempo real permite la lectura más objetiva de los resultados. Por lo tanto, LAMP junto con el kit Loopamp y el fluorímetro solventa las principales limitaciones que presentan las técnicas convencionales a la hora de realizar el diagnóstico de los casos activos en el terreno. Aunque las técnicas moleculares son muy sensibles, no se relacionan directamente con la cura clínica. La respuesta inmune celular persiste en el tiempo y se desarrolla tras un tratamiento efectivo. En consecuencia, ensayos que midan la respuesta inmune celular son más efectivos para identificar los individuos asintomáticos y para determinar la cura de la enfermedad. Es por ello que empleamos el ensayo de estimulación de sangre completa WBA y la cuantificación de analitos con el fin de identificar nuevos biomarcadores de infección y cura. En este estudio se realizó por primera vez el seguimiento de pacientes VL desde el momento activo y trimestralmente hasta los 12 meses posttratamiento. Encontramos que IFNg y CXCL9 son capaces de identificar a todos los pacientes curados a los 6 y 12 meses post-tratamiento. Asimismo, evaluamos el WBA en la identificación de sujetos con infección asintomática. Nuestros resultados demostraron que IL2, CXCL9 y CXCL10 fueron los biomarcadores óptimos en la detección de la infección asintomática en área endémica de L. infantum y L. donovani, respectivamente. A pesar de los resultados prometedores, el plasma estimulado requiere de refrigeración para su almacenamiento y transporte. Para solventar esta limitación empleamos el papel de filtro como herramienta soporte para su almacenamiento. Los resultados mostraron que los analitos eluidos del papel de filtro tienen una excelente correlación con los analitos del plasma estimulado. Por lo tanto, el empleo del papel de filtro es útil en estudios de campo que no dispongan de cadena de frío. El último capítulo, permitió evaluar del WBA y la cuantificación de IL2 en una encuesta epidemiológica en Fuenlabrada, Madrid. Los resultados mostraron que hay una prevalencia de infección asintomática elevada en esta zona post-brote y que la edad, el sexo, el lugar de residencia, el tipo de casa y el uso de insecticida son factores de riesgo asociados a la infección asintomática. Los resultados de esta tesis han abordado algunas de las limitaciones actuales existentes en el control de la leishmaniasis, como son la necesidad de herramientas de campo para la detección de la infección activa y asintomática, y para determinar la cura tras el tratamiento de la VL. Los biomarcadores descritos van a facilitar nuevos estudios en encuestas epidemiológicas, que nos ayudarán a estimar la prevalencia real de la leishmaniasis y la tasa de cura o recaída, asociados al tratamiento de la leishmaniasis visceral.