Desarrollo y aplicación clínica de técnicas de diagnóstico molecular para la determinación del genotipo fetal

Resumen

El cribado y diagnóstico prenatal se ofrecen rutinariamente dentro de los cuidados asistenciales a la embarazada. Existen dos parámetros que es fundamental considerar en este entorno: la precocidad en la obtención del resultado y la valoración del riesgo asociado a la prueba frente al rendimiento diagnóstico. En esta tesis, se describe el desarrollo y posterior aplicación clínica de dos metodologías que se constituyen en herramientas básicas en la determinación del genotipo fetal, teniendo como objetivo último la reducción del número de pruebas invasivas. En relación al diagnóstico precoz de aneuploidias, se analizaron mediante este ensayo 3578 muestras pertenecientes a embarazos de alto riesgo de cromosomopatía. Se diseñaron 2 ensayos en multiplex, mediante PCR Cuantitativa Fluorescente (QF-PCR), con un total de 14 secuencias específicas para los pares 13 (3), 18 (3), 21 (3) y par sexual (5). La sensibilidad y especificidad obtenida fue del 97% y del 100% respectivamente. Se estimó el riesgo residual de cromosomopatía no aneuploidía entre un 0,57% y un 0,79% según el criterio de inclusión utilizado. Se evaluó su aplicabilidad en casos de mosaicismo, detección del origen de aneuploidías, contaminación materna y establecimiento de la zigosidad en embarazos gemelares. Como técnica exenta de riesgo para el embarazo, se realizó diagnóstico prenatal no invasivo a 404 muestras de plasma materno a embarazadas de 6 a 23 semanas de gestación. En todos los casos se realizó determinación del sexo fetal y en 63 embarazadas con Rh negativo se realizó además la determinación del Rh fetal. Se diseñaron estudios de PCR en tiempo real para el análisis de sexo fetal con sondas TaqMan MGB para los genes SRY, TPSY (DYS14) y DAZ, con una sensibilidad y especificidad del 100% y 99,5% respectivamente. Para la determinación del status RhD fetal se diseñó una aproximación utilizando sondas TaqMan MGB para los exones 7, 5 y 10 del gen RHD. La sensibilidad y especificidad en este caso fue del 92,6% y 100%, respectivamente. En ambos ensayos se generó un algoritmo diagnóstico aplicable a la práctica clínica. Adicionalmente, se realizaron análisis mediante cuantificación absoluta de las cantidades obtenidas de ADN fetal libre según la edad gestacional y el método de extracción utilizado. En conjunto, nuestros resultados muestran a estas dos aproximaciones como técnicas con un alto grado de intercambiabilidad frente a la citogenética convencional para las determinaciones para las que han sido diseñadas, sentando la base del diagnóstico prenatal genético del futuro