Specific roles of endolysosomal trafficking in melanoma progression and drug response

Zusammenfassung

Summary Melanoma was first described as a tumor entity in 1806, and it has since remained a prime example of a heterogeneous, aggressive and treatment-resistant malignancy. Despite great progress made in the understanding of the molecular basis underlying melanoma initiation and progression, the field still lacks clinically relevant biomarkers, consensus on metastatic progression mechanisms and effective treatments for the management of advanced stages. Consequently, this PhD thesis was set to: (1) identify new genes driving melanoma pathogenesis, (2) characterize their role in tumor initiation and progression, and (3) use this information for the development of novel therapeutic strategies. We focused on the study of lineage-specific traits as a strategy to identify novel factors that might be inherently and distinctively altered in melanoma. Mining of multi-tumor gene expression data sets identified a cluster of lysosomal genes that is uniquely enriched in melanoma cells and that distinguishes this tumor type from over 35 malignancies. Within this cluster, we demonstrated a dependency of melanoma cells on the GTPase RAB7, which was observed to maintain cell proliferation in a tumor type-selective manner. In contrast to classical melanoma-associated oncogenes such as BRAF, whose depletion blocks both cell proliferation and invasion, tuning down RAB7 favored the transition to metastatic stages. RAB7 levels were found to affect melanoma cell phenotype by modulating the fate of PI3K-driven vesicles, which instead of being directed towards the lysosome for degradation, accumulated and were diverted into secretory pathways when RAB7 expression was tuned-down. The outcome of derailed RAB7-regulated vesicle traffic translated into melanoma-cell selective changes in gene expression profiles, cytoskeletal reorganization, and secretion modulators of extracellular proteolysis and matrix remodeling. Importantly, we found RAB7 to be expressed independently of MITF, the best known lineage-specific melanoma oncogene characterized to date. Instead, we identified that, in melanoma cells, RAB7 levels are controlled by both SOX10, an early driver of the melanocytic lineage, and PI3K signaling, which is frequently activated during tumor initiation. These results were revealed by computational methods, live microscopy, histological and functional analyses of human biopsies, cell lines and mouse models. Moreover, the clinical relevance of these results was demonstrated in follow-up studies of patient prognosis. Finally, here we demonstrated that tumor-cell specific features of RAB7-dependent vesicle traffic have the potential to be exploited therapeutically. Specifically, we found a novel strategy (based on dsRNA-based nanocomplexes) to promote an efficient self-killing of melanoma cells by inducing a massive mobilization of autophagosomes, endosomes, and lysosomes, and the subsequent activation of apoptotic caspases. Together, the results of this PhD thesis underscore a unique lineage-restricted wiring of endolysosomal pathways that actively contributes to melanoma progression and serves as a tractable vulnerability that can be pursued for drug development. Key words: Lineage dependency; macropinocytosis; late endosomes; small GTPases; tumor development; cell invasion; melanoma. Resumen El melanoma se describió por primera vez como una entidad tumoral en 1806, y desde entonces, se mantiene como ejemplo de neoplasia agresiva, heterogénea y quimiorresistente. A pesar de avances notables en la compresión de las bases moleculares de la progresión del melanoma, no se dispone de biomarcadores con suficiente valor pronóstico. Del mismo modo, no existe un consenso sobre los mecanismos que subyacen al proceso de metástasis, ni se han desarrollado tratamientos eficaces para las fases avanzadas de la enfermedad. Por todo ello, esta tesis doctoral se ha centrado en: (1) identificar nuevos genes esenciales para el desarrollo del melanoma, (2) definir su regulación y su función en la progresión tumoral, y (3) utilizar esta información para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. En particular, nos centramos en el estudio de características específicas de linaje celular con el fin de identificar nuevos factores pro-oncogénicos inherentes al melanoma. El análisis de perfiles de expresión génica de diversos tipos tumorales reveló que las muestras de melanoma presentan un enriquecimiento selectivo de genes codificantes de proteínas lisosomales, que distingue a este tipo de cáncer de más de otros 35 tipos tumorales distintos. Dentro de esta huella genética, identificamos la GTPasa RAB7 como un nuevo gen esencial para el mantenimiento de la capacidad proliferativa de estas células tumorales. A diferencia de ¿oncogenes¿ clásicos como BRAF, cuya inactivación inhibe tanto la proliferación como la invasión tumoral, la reducción en los niveles de RAB7 favorece la transición a estadios metastásicos. Encontramos que esta doble función oncogénica de RAB7 se debe a su capacidad para regular el destino final (degradación o reciclaje) de vesículas citoplasmáticas inducidas por rutas oncogénicas que activan PI3K. La desregulación de tráfico vesicular controlado por RAB7 produce cambios globales en los perfiles de expresión génica de las células de melanoma, afectando a genes implicados en rutas de señalización clave en cáncer. Además, afecta al citoesqueleto y la secreción de factores involucrados en la remodelación de la matriz extracelular. Por otro lado, determinamos que RAB7 se expresa y actúa de manera independiente de MITF, el oncogén específico de melanoma mejor conocido hasta el momento. En cambio, demostramos que la expresión selectiva de RAB7 en las células de melanoma está controlada específicamente por SOX10, el factor más apical en la diferenciación melanocítica, y por la vía de señalización de PI3K, activada frecuentemente durante la iniciación tumoral. El papel de RAB7 en la progresión del melanoma se determinó mediante estudios en líneas celulares humanas, biopsias clínicas y modelos animales. Además, la relevancia clínica de estos datos se determinó en estudios de seguimiento a 10 años, en los que se demostró que los niveles de expresión de RAB7 determinan el riesgo de desarrollo de metástasis en pacientes. Finalmente, demostramos que las rutas de tráfico vesicular dependientes de RAB7 que están específicamente activadas en células tumorales pueden constituir nuevas dianas terapéuticas. En concreto, desarrollamos una estrategia (basada en nanopartículas de ARN de doble cadena) para inducir la autodestrucción de las células tumorales a través de la movilización de macroendosomas, autofagosomas y lisosomas, y la posterior activación de caspasas apoptóticas. En conjunto, los resultados de esta tesis doctoral han revelado una regulación y activación de la maquinaria endolisosomal que se establece de forma específica en el melanoma, contribuyendo a la progresión de esta enfermedad, y que, por otro lado, también confiere una vulnerabilidad a las células tumorales que puede ser explotada con fines terapéuticos. Palabras claves: adicción oncogénica; linaje celular; macropinocitosis; endosomas; pequeñas GTPasas; progression tumoral; invasión tumoral; melanoma.