Estudio del mecanismo de muerte asociado a la terapia antitumoral linamarasa/linamarina/glucosa oxidasa

Resumen

Introducción........................................................................................................5 Muerte celular programada......................................................................................5 Necrosis...................................................................................................................5 Apoptosis..................................................................................................................9 Muerte independiente de caspasas........................................................................14 CÁNCER................................................................................................................16 Sistema lis/lin/GO...................................................................................................18 Implicación de la muerte celular en la carcinogénesis...........................................18 Autofagia................................................................................................................20 Autofagia, un mecanismo de muerte celular muy eficiente....................................22 Mitofagia: Reciclando la mitocondria, un juego entre la vida y la muerte...............23 Tumorigénesis y autofagia: un equilibrio de muerte...............................................24 Objetivos............................................................................................................25 Materiales y Métodos.........................................................................................27 Reactivos especiales..............................................................................................27 Anticuerpos............................................................................................................27 Plásmidos...............................................................................................................28 Construcciones de RNA de interferencia.................................................................30 Vectores virales......................................................................................................30 Adenovirus..................................................................................................................30 Lentivirus.....................................................................................................................30 Retrovirus.....................................................................................................................31 Cultivos celulares...................................................................................................31 Medios y condiciones de cultivo...............................................................................31 Células.........................................................................................................................31 Obtención de cultivos primarios de explantes de tumores....................................33 Transfección de células..........................................................................................33 Determinación de la supervivencia celular.............................................................33 Índice II Infección con adenolis in vitro................................................................................34 Inmunofluorescencias............................................................................................34 Análisis de las modificaciones estructurales de la mitocondria .............................34 Marcaje de autofagosomas....................................................................................35 Medición de estrés oxidativo..................................................................................35 Medición del potencial de membrana.....................................................................35 Análisis del tipo de muerte por citometría de flujo (Anexina V-FITC/IP o Anexina V-PE/7-AAD)...........................................................................................36 Ensayo de formación de colonias...........................................................................36 Proteínas................................................................................................................36 Obtención de extractos de proteínas totales................................................................36 Preparación de fracciones enriquecidas citosólicas y mitocondriales..........................37 Electrotransferencia e inmunodetección de proteínas (Western blot)..........................37 Tratamiento de los ratones.....................................................................................37 Análisis estadístico de los datos.............................................................................38 Resultados.........................................................................................................39 El sistema linamarasa/linamarina/glucosa oxidasa genera una rápida y eficiente muerte de las células tumorales...........................................................................39 Caracterización morfológica de la muerte inducida por el sistema combinado lis/lin/GO...............................................................................................................44 Análisis de los mecanismos moleculares en la muerte celular inducida por daño mitocondrial en combinación con estrés oxidativo............................................49 La combinación de cianuro con peróxido de hidrógeno mata a las células tumorales U-87 MG dañando las mitocondrias sin activar la caspasas y sin participación de AIF...............................................................................................55 La generación de daño mitocondrial agudo en combinación con estrés oxidativo es un potente inductor de autofagia.............................................................................58 Daño mitocondrial, estrés oxidativo y proteínas de estrés...............................................58 Participación de las vacuolas autofágicas en la muerte generada por el sistema lis/lin/GO......................................................................................................................61 Participación de los lisosomas en la fase degradativa de la muerte por autofagia.......68 Inducción de muerte por autofagia in vivo en un modelo de xenotransplante de Índice III tumores humanos........................................................................................................70 Estudio de proteínas implicadas en el mecanismo de autofagia......................................71 Estrecha relación entre apoptosis y autofagia: el bloqueo de los mecanismos de generación de autofagia facilita la activación de apoptosis y viceversa..........72 La transformación tumoral sensibiliza a las células a morir por autofagia demostrando su potencial terapéutico..................................................................75 Discusión.........................................................................................................79 Capacidad citotóxica y terapéutica del sistema lis/lin/GO......................................79 Cambio entre pérdida o mantenimiento de la integridad de membrana plasmática............................................................................................................81 Lisosomas: ¿Es Hsp70 un protector universal de la muerte celular?....................82 El papel de la mitocondria en la muerte desencadenada por el sistema lis/lin/GO...............................................................................................................83 Autofagia, mitofagia y muerte celular.....................................................................87 Autofagia, apoptosis y tumorigénesis desencadenada por oncogenes...............89