Análisis funcional de la proteína 3A del virus de la fiebre aftosa

Resumen

Abreviaturas Abreviaturas 1 Resumen en inglés Resumen en inglés 7 Introducción I-1 La fiebre aftosa 11 I-2 El virus de la fiebre aftosa 13 I-2-1 Genoma del VFA 14 I-2-2 Proteínas del VFA 15 I-2-3 Ciclo infectivo 17 I-2-3-1 Internalización celular 17 I-2-3-2 Traducción y procesamiento proteolítico 18 I-2-3-3 Replicación del ARN 20 I-2-3-4 Encapsidación y maduración 23 I-2-4 La proteína 3A de los picornavirus 24 I-2-4-1 Proteína 3A de Poliovirus 27 I-2-4-2 Proteína 3A del VFA 29 Objetivos Objetivos 35 Material y Métodos M-1 Lineas celulares y vírus 39 M-2 Clones infecciosos 40 M-3 Anticuerpos 41 M-4 Cultivo de células 42 M-5 Crecimiento de vírus 42 M-6 Obtención de ADN plasmídico 43 M-7 Extracción de ARN 43 M-8 Clonaje molecular: clones infecciosos de la proteína 3A 43 M-8-1 Metodología empleada para la construcción de los clones infecciosos mutantes 45 M-8-1-1 Deleción de la proteína 3A del VFA. Mutante pMT28- 3A 45 M-8-1-2 Mutante de inserción pMT28-G-3A-G 47 M-8-1-3 Mutante de inserción pMT28-G-3A 48 M-8-1-4 Sustitución de la proteína 3A por su homóloga del VRE-A. 48 Mutantes pMT28-3A-VRE-C y pMT28-3A-VRE-I M-8-1-5 Mutantes puntuales 49 M-9 Construcción de plásmidos derivados del pRSV portando versiones 51 mutadas de la proteína 3A del VFA M-10 Transcripción in vitro 52 M-11 Transfección en cultivos celulares 53 M-11-1 Transfección con ARN 53 M-11-2 Transfección con ADN 53 M-12 Titulación de virus 53 M-13 Determinación de la infectividad esppecífica del ARN de los mutantes. 54 M-14 Traducción in vitro 54 M-14-1 Cuantificación de incorporación de radiactividad 54 M-14-2 Análisis de las proteínas marcadas con 35S mediante electroforesis en gel de poliacrilamida 55 M-15 Ensayo de sensibilidad a Brefeldina A 55 M-16 Condiciones empleadas en las amplificaciones por PCR 55 M-16-1 RT-PCR 56 M-16-2 PCR en tiempo real 56 M-17 Inmunoensayos 57 M-17-1 Western-Blot 57 M-17-2 Inmunoprecipitación 58 M-17-3 Inmunofluorescencia 59 M-18 Ensayo de letalidad en ratón lactante 59 M-19 Métodos estadísticos y tratamiento de datos 60 M-20 Disoluciones y tampones 60 M-21 Oligonucleótidos 61 Resultados R-1 Construcción de clones infecciosos del VFA para la obtención de virus mutantes en 3A 65 R-1-1 Mutantes de delección 66 R-1-2 Mutantes de inserción 67 R-1-3 Mutantes de reemplazo de 3A 68 R-1-4 Mutantes puntuales 71 R-2 Síntesis y procesamiento in vitro de la poliproteína viral de los distintos mutantes de 3A 74 R-3 Infectividad del ARN de mutantes de 3A en cultivos celulares 78 R-3-1 Citopatogenicidad de mutantes de 3A en células BHK-21 78 R-3-2 Citopatogenicidad de mutantes de 3A en células VERO 81 R-3-3 Producción de virus infectivos a partir del ARN de los mutantes de la proteína 3A 82 R-3-3-1 Infectividad específica del ARN de los mutantes de 3A 82 R-3-3-2 Cuantificación de la producción viral de mutantes de la proteína 3A 84 R-3-4 Expresión de proteínas virales de los mutantes de la proteína 3A en cultivos celulares 86 R-3-4-1 Análisis mediante western-blot 86 R-3-4-2 Análisis por inmunofluorescencia de productos virales en células transfectadas con ARN de mutantes de la proteína 3A 89 R-3-5 Estudio de la expresión transitoria de las proteínas mutadas en los residuos L38E y L41E 92 R-3-6 Análisis de la producción de ARN viral en células transfectadas con ARN de mutantes de 3A 94 R-3-6-1 Detección de la producción de ARN viral por RT-PCR semicuantitativa 94 R-3-6-2 RT-PCR a tiempo real 95 R-4 Evaluación de la posible complementación en trans de mutantes de la proteína 3A 97 R-4-1 Producción de ECP por ARN de mutantes de la proteína 3A en clones celulares que expresan 3A o 3ABBB 98 R-4-2 Producción viral de mutantes de la proteína 3A en clones celulares que expresan 3A o 3ABBB 101 R-5 Patogenicidad de los ARNs de mutantes de 3A en ratón lactante 103 Discusión D Estudio funcional de la proteína 3A 109 D-1 Mutantes de deleción de 3A 111 D-2 Mutantes de sustitución por la proteína 3A del VRE-A 115 D-3 Mutantes de inserción 117 D-4 Mutante pMT28-C65S 120 D-5 Mutantes pMT28-Q44R y pMT28-Q44D 120 D-6 Mutantes pMT28-L38E y pMT28-L41E 122 D-7 Consideraciones finales 124 Conclusiones Conclusiones 129 Bibliografía Bibliografía 133 Anexo Rosas, M. F., Y. A. Vieira, R. Postigo, M. A. Martin-Acebes, R. Armas-Portela, E. Martinez-Salas, and F. Sobrino. 2008. Susceptibility to viral infection is enhanced by stable expression of 3A or 3AB proteins from foot-and-mouth disease virus. Virology 380:34-45.