Estudio de la regulación del tráfico intracelular del transportador de glutamato GLT1

Resumen

El glutamato liberado sinápticamente se inactiva por acción de sus transportadores, lo que impide la excesiva estimulación de los receptores de glutamato que producen neurotoxicidad. GLT1 es el principal transportador de glutamato en el SNC y su actividad y su tráfico intracelular puede ser regulado por diferentes efectores y quinasas. Se sabe que la activación de la PKC por ésteres de forbol promueve la internalización del transportador mediante un sistema dependiente de clatrina. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los que la activación de PKC induce la internalización de GLT1 no se conocen. En este trabajo, se muestra que el proceso de internalización es dependiente de la ubiquitinación de los residuos de lisina localizados en el extremo carboxilo de GLT1. La exposición a PMA aumenta la ubiquitinación de GLT1 en células transfectadas y la GLT1 ubiquitinada se acumula en el compartimiento intracelular. La eliminación de las siete lisinas de la C-terminal del transportador bloquea la ubiquinación de GLYT1 y su endocitosis. Sin embargo, la reintroducción de la lisina 517 en este mutante era suficiente para restablecer la ubiquitinación dependiente de PMA y la internalización de GLT1. También se ha demostrado que la PKC fosforila GLT1 en la serina 520 de su C-terminal en respuesta al tratamiento de PMA, aunque esta fosforilación no es necesaria para la ubiquitinación de GLT1 y posterior endocitosis. Además, la ligasa E3 Nedd4-2 parece participar en este proceso. Nuestros datos también demuestran que la ubiquitinación juega un papel importante no sólo en la endocitosis sino también en la regulación de otros aspectos del tráfico intracelular de GLT1, como salida desde el retículo endoplásmico y el tránsito a través del aparato de Golgi. Además, la ubiquitinación de GLT1 podría desempeñar un papel en la regulación de esta proteína observada en diversas patologías como la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). En otra serie de experimentos se ha demostrado la interacción de ambas isoformas de GLT1, GLT1a y GLT1b, con los MALS, una proteína pequeña de andamiaje, en células COS7, aunque fuimos incapaces de detectar esta interacción en las neuronas. Finalmente, se ha desarrollado un sistema de expresión para GLT1 usando el virus Sindbis para estudiar el tráfico intracelular in vivo de este transportador en cultivos primarios de neuronas de rata. Los resultados obtenidos por la técnica de FRAP indican que las isoformas A y B de GLT1 no son estáticas en las espinas dendríticas de las neuronas primarias, sin no que se mueven rápidamente dentro de ellas. Synaptically released glutamate is inactivated by glutamate transporters, thereby preventing the excessive stimulation of glutamate receptors that would produce neurotoxicity. GLT1 is the main glutamate transporter in the CNS and its activity and intracellular traffic can be regulated by different effectors and kinases. It is known that activation of PKC by phorbol esters promotes the clathrin-dependent internalization of the transporter. However, the molecular mechanisms that link PKC activation and the internalization of GLT1 are not fully understood. In this work, we show that this internalization process is dependent on the ubiquitination of lysine residues located in the C-terminal tail of GLT1. Exposure to PMA increases the ubiquitination of GLT1 in transfected cells and this ubiquitinated GLT1 accumulates in the intracellular compartment. The elimination of the seven lysines from the C-terminus of the transporter blocked GLT1 ubiquitination and endocytosis. However, reintroduction of lysine 517 alone into this mutant was sufficient to restore PMA dependent ubiquitination and internalization of GLT1. We also have demonstrated that PKC phosphorylates GLT1 in the serine 520 of its C-terminal tail in response to the treatment of PMA, although this phosphorylation is not necessary for GLT1 ubiquitination and subsequent endocytosis. Moreover, the E3 ligase Nedd4-2 seems to participate in this process. We also provide evidences that ubiquitination plays an important role not only in endocytosis but also in the regulation of other aspects of the intracellular traffic of GLT1, including exit from the endoplasmic reticulum and transit through the Golgi apparatus. Furthermore, ubiquitination of GLT1 might play a role in the down regulation of this protein observed in diverse pathologies like amyotrophic lateral sclerosis (ALS). In another series of experiments we have shown the interaction of both isoforms of GLT1, GLT1a y GLT1b, with the small scaffold protein MALS in COS7 cells, although we were unable to detect such an interaction in neurons. Finally, we have developed an expression system for GLT1 using the SindBis virus to study the intracellular traffic in vivo of this transporter in primary cultures of rat neurons culture. The results obtained by FRAP technique indicate that the isoforms a and b of GLT1 are not static at dendritic spines of primary neurones, but they move fast within them.