Nuevos modelos genéticos murinos para el estudio del endotelio vascular sanguíneoanálisis de la relevancia de c-Met durante la neovascularización en el ratón

Resumen

La generación de nuevos vasos sanguíneos es una capacidad fisiológica vital que participa activamente en la patogenia de muchas enfermedades, entre ellas el cáncer. La modulación de la homeostasis vascular depende en gran medida de las células endoteliales, que regulan no sólo el crecimiento de los nuevos vasos sino también las funciones de barrera y los mecanismos de respuesta vascular. La identificación de genes asociados al fenotipo endotelial ha permitido la generación de herramientas para su estudio y a partir de ello, un análisis más específico de sus funciones. Uno de estos genes es Tie2 que codifica para un receptor de angiopoietinas con actividad tirosina quinasa. Mediante gene targeting por recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón, se ha generado un modelo knockin (Tie2CreERT2) que expresa la recombinasa Cre inducible por tamoxifeno CreERT2 bajo la regulación transcripcional endógena del gen Tie2. A través del cruce con una línea trazadora de la actividad de Cre (Rosa26LSLlacZ) se comprobó que el modelo es capaz de inducir la recombinación de secuencias genéticas específicamente en las células endoteliales. Los resultados obtenidos validan este sistema como una excelente herramienta para la modificación condicional de genes en el endotelio vascular sanguíneo y en consecuencia para el estudio genético de los mecanismos moleculares que gobiernan la respuesta vascular. Adicionalmente, la caracterización del modelo ha permitido estudiar el patrón de expresión de Tie2 durante la neovascularización fisiológica asociada al desarrollo embrionario y la angiogénesis retinal y durante la quiescencia vascular en el organismo adulto. La vía de señalización mediada por HGF/c-Met es relevante en la progresión tumoral incluyendo el desarrollo de metástasis y la neovascularización. Algunos inhibidores de c-Met han demostrado actividad antitumoral y antiangiogénica por lo que resulta importante conocer las funciones específicas de dicho receptor en las células endoteliales. Mediante cruzamiento del modelo Tie2CreERT2 con una línea knockout condicional de c-Met, se estudió la contribución de la actividad tirosina quinasa de dicho receptor a la transmisión de señales capaces de modular la respuesta angiogénica del endotelio vascular sanguíneo. Los resultados obtenidos sugieren que la señalización mediada por la fosforilación de c-Met en las células endoteliales es prescindible y que no juega un papel fundamental en el control de la neovascularización asociada a procesos como el desarrollo embrionario, gestación, regeneración tisular, inflamación o carcinogénesis. Adicionalmente, se demuestra que la inactivación de c-Met no interfiere con los mecanismos de reclutamiento y extravasación de células inflamatorias en contextos patológicos. Por otra parte, hemos generado un modelo transgénico (Tg.CAG-LSL-Katushka) que expresa la proteína roja fluorescente Katushka, bajo el control del promotor ubicuo CAG, exclusivamente tras eventos de recombinación mediados por Cre. Mediante el cruce con diversas líneas transgénicas que expresan Cre de forma ubicua o tejido-específica se ha demostrado la idoneidad de este modelo para detectar, incluso mediante técnicas de imagen no invasivas en el animal completo, aquellas poblaciones celulares en las que ha ocurrido recombinación mediada por Cre. Esta línea trazadora en conjunto con el modelo Tie2CreERT2 permite el marcaje fluorescente y visualización del endotelio vascular además de facilitar la identificación de células hematopoyéticas que expresan Tie2. Adicionalmente, tras recombinación del alelo Tg.CAG-LSL-Katushka en la línea germinal, se estableció un modelo murino con expresión constitutiva y ubicua de Katushka. Estos ratones constituyen una herramienta valiosa para el trazado de linajes ya que representan una fuente biológica de células fluorescentes de fácil detección, capaces de transmitir dicha característica identificativa a toda su descendencia. Además, éste modelo permite, mediante la adquisición de fluorescencia nativa por microscopía confocal, la visualización detallada de la vasculatura de la retina y la piel del pabellón auricular, dos sistemas de análisis ampliamente utilizados en el estudio de la biología vascular. Finalmente, tras el cruce con ratones atímicos desnudos Foxn1nu, se generó una línea receptiva a la implantación de tumores por xenotransplante; dicho modelo, en virtud de su emisión de fluorescencia, posibilita la fehaciente identificación de células del hospedero en el microambiente del tumor y permite visualizar las interacciones en el estroma con especial atención a la neovascularización tumoral.