Exocitosis y endocitosis reguladas por dos modos diferentes de entrada de calcio

Resum

El trabajo presentado en esta Tesis Doctoral ha sido desarrollado en el Instituto Teófilo Hernando de I+D del Medicamento (ITH) de la Universidad Autónoma de Madrid. A lo largo de más de tres décadas, el ITH ha cultivado una amplia y sólida línea de investigación relacionada con la caracterización de los principales mecanismos celulares en los que está implicado el catión calcio (Ca2+). Entre ellos, hacemos hincapié en la comunicación interneuronal y en los mecanismos de muerte neuronal por apoptosis y necrosis. El Ca2+ es uno de los mediadores intracelulares más versátiles de todo el organismo. Interviene en procesos tan diversos como la contracción muscular, la secreción hormonal y de neurotransmisores, la coagulación de la sangre, el metabolismo celular, la expresión de genes, la fecundación, la inmunidad, el envejecimiento, la muerte celular... Una importante característica del Ca2+ es que la célula no puede producirlo ni destruirlo, sino únicamente controlar sus concentraciones intracelulares. El nivel citosólico de Ca2+ libre ([Ca2+]c) en una célula en reposo suele permanecer alrededor de 10-100 nM, pero tras una estimulación, la concentración intracelular de este ión puede incrementarse hasta alcanzar niveles iguales o incluso superiores a 1 ¿M. Para regular estas variaciones, la célula se sirve de mecanismos capaces de controlar el aumento y/o la disminución de la concentración de la [Ca2+]c. Entre los mecanismos que controlan el aumento de Ca2+ se incluyen diversos subtipos de canales de Ca2+dependientes de voltaje (CCDV) y receptores presentes en la membrana plasmática, que permiten la entrada de Ca2+ extracelular, y receptores presentes en el retículo endoplásmico (RE), que movilizan Ca2+ desde estes depósito. Respecto a los mecanismos que contribuyen a disminuir los niveles citosólicos de Ca2+, cabe destacar que la célula cuenta con diversas proteínas que unen Ca2+ y con una serie de bombas y transportadores de membrana que movilizan el Ca2+ desde el citosol hacia depósitos intracelulares o hacia el medio extracelular. En los últimos 30 años, nuestro grupo ha realizado diversos estudios encaminados al esclarecimiento del papel del Ca2+ como mediador de los procesos de neurotransmisión. Para una revisión reciente, ver Garcia et al. (2006). También el ITH ha cultivado durante la última década una línea de investigación relacionada con el Ca2+ y su implicación en los procesos de muerte neuronal (Cano-Abad et al., 2000; Cano-Abad et al., 2001; Cano-Abad et al., 2002; Sobrado et al., 2003; Egea et al., 2007), intentado establecer un posible vínculo con enfermedades neurodegenerativas como la Enfermedad de Alzheimer. Nuestro modelo experimental por excelencia es la célula cromafín de la médula suprarrenal. En este tipo celular se realizaron los primeros registros electrofisiológicos de canal único y se descubrieron las primeras proteínas implicadas en la exocitosis y en la endocitosis. Como las neuronas, la célula cromafín posee diferentes subtipos de CCDV. Hace años que en nuestro grupo trabajamos en la búsqueda de nuevas estrategias experimentales para confirmar nuestra hipótesis de que el Ca2+ que entra en la célula a través de los distintos subtipos de CCDV (L, N, PQ y R), ejerce funciones diferentes. La presente Tesis está relacionada con dos de las líneas de investigación que se desarrollan actualmente en el ITH, a saber, (1) la implicación del Ca2+ y esfingolípidos de membrana en los procesos de neurotransmisión: exocitosis y endocitosis; y (2) la caracterización funcional de los distintos subtipos de CCDV. Además, intentamos hacer una correlación de todos estos aspectos a procesos fisiopatológicos como la Enfermedad de Alzheimer. Para el desarrollo de los experimentos de esta Tesis, nos hemos servido de uno de los principales avances tecnológicos para el estudio del Ca2+, la técnica de patch-clamp desarrollada por Bert Sakmann y Erwin Neher (Hamill et al., 1981). Esta técnica nos permite estudiar las corrientes de entrada de Ca2+ por los diferentes subtipos de CCDV y su implicación en los procesos exo- y endocitóticos mediante el registro de la capacidad de la membrana a tiempo real (Korn & Horn, 1989; Gillis et al., 1991). Así como técnicas fotométricas para corroborar los datos eletrofisiológicos, marcaje con anticuerpos para estudiar la colocalización de las proteínas endocitóticas y CCDV y técnicas de fotoliberación de calcio intracelular.