Análisis estructural del centrómero en Drosophila melanogaster

Resumen

ÍNDICE RESUMEN.............................................................................1 SUMMARY .........................................................................3 1. INTRODUCCIÓN.................................................................5 1.1. LA HETEROCROMATINA.........................................................7 1.1.1. La heterocromatina de Drosophila melanogaster ...................................................9 1.2. LOS TELÓMEROS..................................................................15 1.2.1. Los telómeros en D. melanogaster .......................................................................16 1.3. EL CENTRÓMERO..................................................................18 1.3.1. El centrómero en D. melanogaster........................................................................20 1.3.1.1. El centrómero del cromosoma Y..................................................................................21 1.3.1.2. El centrómero del cromosoma 3 ..................................................................................22 1.4. SECUENCIACIÓN DE DNA ALTAMENTE REPETIDO ...................................22 2. OBJETIVOS .............................................................................23 3. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................29 3.1. MATERIALES................................................................31 3.1.1. Mantenimiento de D. melanogaster y otras especies de Drosophila....................31 3.1.2. Mantenimiento de líneas celulares de D. melanogaster .......................................31 3.1.3. Medios de cultivo bacteriano y soluciones............................................................31 3.2. MÉTODOS .........................................................................32 3.2.1. Preparación del DNA.............................................................................................32 3.2.1.1. DNA genómico......................................................................32 3.2.1.2. DNA de BACs...........................................................................32 3.2.1.3. DNA de plásmidos..............................................................................32 3.2.1.4. Extracción del DNA de geles de agarosa.....................................................................32 3.2.2. Marcaje de sondas radioactivas............................................................................33 3.2.2.1. Marcaje con a32P dCTP ................................................................................................33 3.2.2.2. Marcaje con g32P ATP ......................................................................................33 3.2.3. Rastreo de tres genotecas genómicas de D. melanogaster .................................33 3.2.4. Digestión del DNA con enzimas de restricción y endonucleasas "homing"..........34 3.2.5. Electroforesis en geles de agarosa.......................................................................34 3.2.5.1. Electroforesis convencional...................................................................34 3.2.5.2. Electroforesis de campo pulsado .................................................................................34 3.2.6. Amplificación de fragmentos de DNA mediante PCR ...........................................35 3.2.7. Clonación de productos de PCR o fragmentos de DNA obtenidos mediante digestión enzimática .......................................................................35 Análisis estructural del centrómero en Drosophila melanogaster Índice ii 3.2.8. Comprobación de colonias transformantes...........................................................36 3.2.8.1. Comprobación de colonias transformantes mediante PCR .........................................36 3.2.8.2. Comprobación de colonias transformantes mediante digestión con enzimas de restricción ...........................................................................36 3.2.9. Transposición in vitro.............................................................................................37 3.2.10. Transformación del DNA .....................................................................................37 3.2.10.1. Transformación mediante choque térmico .................................................................37 3.2.10.2. Transformación mediante electroporación .................................................................37 3.2.11. Secuenciación del DNA .......................................................................................37 3.2.12. Análisis de la secuencia del DNA........................................................................38 3.2.12.1. Búsqueda de secuencias homólogas en bases de datos y comparación de secuencias. ............................................................................38 3.2.12.2. Ensamblaje de secuencias.........................................................................................38 3.2.13. Hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH) ..........................................38 3.2.13.1. Preparación de cromosomas mitóticos ......................................................................38 3.2.13.2. Marcaje de las sondas ....................................................................................39 3.2.13.3. Condiciones de hibridación ........................................................................................39 3.2.13.4. Inmunodetección de las sondas.................................................................................40 3.2.14. Inmunofluorescencia e hibridación in situ en fibras de cromatina ......................40 3.2.14.1. Preparación de fibras de cromatina ...........................................................................40 3.2.14.2. Inmunofluorescencia............................................................41 3.2.14.3. Hibridación in situ ...............................................................................41 4. RESULTADOS....................................................................43 4.1. EL CENTRÓMERO DEL CROMOSOMA Y DE Drosophila melanogaster ......45 4.1.1. Análisis de la región centromérica h18 .................................................................45 4.1.1.1. Desarrollo de una estrategia de secuenciación para DNA heterocromático................45 4.1.1.2. Obtención del transposón artificial Tn599....................................................................45 4.1.1.3. Validación de la nueva técnica de secuenciación ........................................................48 4.1.1.4. Obtención de una genoteca del BACR26J21 mediante transposición del transposón Tn599...............................................................................48 4.1.1.5. Mapeo de la inserción del transposón Tn599. .............................................................50 4.1.1.6. Comprobación de la aleatoriedad de inserción del transposón en regiones de DNA altamente repetido ..........................................................................................54 4.1.1.7. Secuenciación de los clones ........................................................................................55 4.1.1.8. Ensamblado de la secuencia del BACR26J21.............................................................55 4.1.1.9. Comparación de las secuencias obtenidas para el BACR26J21 en el CBMSO y el WTSI...........................................................................57 4.1.1.10. Organización de la región centromérica de h18 ........................................................58 4.1.1.11. La región centromérica h18 deriva de un telómero....................................................60 4.1.2. Análisis de la región centromérica h17 .................................................................61 4.1.2.1. Identificación de BACs de la región centromérica h17 del cromosoma Y de D. melanogaster. .....................................................................61 4.1.2.2. La región h17 contiene un gran palíndromo. ...............................................................65 4.1.2.3. El palíndromo de la región h17 abarca más de 200 kb ...............................................67 Análisis estructural del centrómero en Drosophila melanogaster Índice iii 4.2. EL CENTRÓMERO DEL CROMOSOMA 3 DE D. melanogaster ....................71 4.2.1. Análisis de la región centromérica del cromosoma 3............................................71 4.2.1.1. La proteína centromérica CID colocaliza con el satélite dodeca en fibras de cromatina......................................................................71 4.2.1.2. Secuencias relacionadas con el espaciador intergénico ribosomal en h53.................73 4.2.1.3. El satélite de 10bp está presente en la región proximal de h52..................................78 4.2.1.4. ¿Existe el satélite de 15bp en D. melanogaster? ........................................................81 4.2.1.5. Análisis de la secuencia obtenida de la región centromérica h53 ...............................82 5. DISCUSIÓN...................................................................87 5.1. LA TÉCNICA DE SECUENCIACIÓN ...............................................................89 5.2. EL CENTRÓMERO EN D. melanogaster ........................................................90 6. CONCLUSIONES.....................................................................99 7. BIBLIOGRAFÍA.....................................................................103 8. PUBLICACIONES........................................................................115 9. ANEXOS .................................................................................119 ANEXO I. Análisis de los retrotransposones teloméricos presentes en el BACR26J21, a partir de la penúltima repetición de la unidad del satellite 18HT.................................................................................121 ANEXO 2. Análisis de la secuencia de una mitad del palíndromo, presente en el BACR07N15...............................................................................137