Podoplanin association with CD44 and lipid rafts relevance for the regulation of cell motility and epithelial plasticity

Resumen

Podoplanina es una pequeña glicoproteína transmembrana cuya expresión se%&/induce en una amplia variedad de tumores humanos, generalmente asociada a la%&/progresión maligna. Cuando se expresa ectópicamente en células epiteliales MDCK%&/provoca una transición epitelio-mesénquima (TEM) y la aparición de un fenotipo más%&/migratorio y metastático. Para la inducción de estos cambios fenotípicos es necesaria%&/la interacción de podoplanina con las proteínas ERM por medio de su dominio%&/citoplasmático. Dicha interacción desencadena la activación de la GTPasa RhoA y de%&/su efector ROCK que fosforila y activa las proteínas ERM.%&/En esta tesis, hemos estudiado interacciones proteína-proteína y proteínalípido%&/mediadas por podoplanina con objeto de definir mejor el mecanismo molecular%&/que subyace bajo su función en la migración celular y la TEM. Hemos demostrado%&/por un lado, que podoplanina interacciona con la isoforma estándar del receptor de%&/hialuronato CD44 (CD44s) para promover la migración celular. En un modelo de%&/carcinogénesis de piel de ratón, la expresión de CD44s se induce coordinadamente%&/con la de podoplanina durante la progresión a carcinomas fusocelulares muy%&/agresivos. CD44s también se induce durante las TEM promovidas por podoplanina y%&/después de la estimulación de células que expresan podoplanina bajo un promotor%&/inducible. Experimentos de co-inmunoprecipitación y FRET-FLIM, demuestran una%&/interacción física entre podoplanina y CD44s. El análisis de la interacción mediante%&/FRET-FLIM nos ha permitido conocer que el complejo entre estas dos glicoproteínas%&/se produce en la membrana plasmática de células aisladas moviéndose. De hecho,%&/la migración inducida por podoplanina, y en concreto la direccionalidad adquirida por%&/estas células requiere de la co-expresión de CD44. Además, la activación de las%&/proteínas ERM inducida por podoplanina también se atenúa tras el silenciamiento de%&/la expresión de CD44. En conjunto estos datos sugieren que la interacción de%&/podoplanina con CD44s tiene un importante papel en la migración direccional de las%&/células tumorales.%&/Por otro lado, hemos descubierto que podoplanina se asocia con%&/microdominios ricos en colesterol (balsas lipídicas) en células MDCK. Las%&/construcciones quiméricas donde se ha substituido el dominio transmembrana (TM)%&/de podoplanina por el de otras proteínas de localización y función diferente o el%&/mutante que carece de su dominio citoplasmático (CT), pierden la asociación a%&/balsas lipídicas y son incapaces de promover la activación de las proteínas ERM, la%&/TEM o la migración celular. Efectos similares se obtuvieron tras la mutación de un%&/motivo GXXXG en el dominio TM de podoplanina involucrado en su%&/homodimerización. Sin embargo, la deleción del dominio extracelular no tuvo efecto%&/sobre la localización de podoplanina a balsas lipídicas. Estos datos sugieren que los%&/dominios TM y CT son ambos necesarios para la asociación de podoplanina en%&/balsas lipídicas y que dicha inclusión es necesaria para la TEM y migración inducidas%&/por podoplanina.