Caracterización de las interacciones del citomegalovirus humano con las membranas celulares

Résumé

El citomegalovirus humano (CMVH) depende de su interacción con los sistemas de membranas intracelulares para llevar a cabo su morfogénesis. Sin embargo, la naturaleza de esas membranas y los mecanismos que subyacen a esos procesos apenas se conocen. Se piensa que el CMVH adquiere su envoltura final de las membranas de la red de vesículas del trans-Golgi o ¿trans-Golgi-network (TGN)¿, o bien de membranas de la ruta endocítica de transporte. En esta tesis doctoral estudiamos la localización de marcadores de proteínas celulares en células infectadas con el CMVH y en viriones aislados. Las tinciones mediante inmuno-fluorescencia indican que el virus recluta tanto marcadores del TGN como marcadores de endosomas al sitio de ensamblaje. La tinción mediante inmuno-marcaje con oro de viriones aislados muestra la incorporación al sitio de ensamblaje de marcadores del TGN como el TGN46, de marcadores de endosomas, como son el marcador del antígeno-1 de endosomas tempranos, la anexina I, el receptor de la transferrina y el marcador de endosomas tardíos CD63, y de marcadores de la ruta de transporte entre el TGN y los endosomas, como el receptor independiente de cationes de la manosa-6-fosfato. Los ensayos de inmuno-precipitación de viriones que contenían los marcadores TGN46 y CD63, mostraron que estos viriones eran infectivos. Este estudio reconcilia la aparente controversia existente en el campo respecto a la naturaleza del sitio de ensamblaje del CMVH, y sugiere que el CMVH tiene la habilidad de generar un nuevo compartimento membranoso que contiene marcadores tanto del TGN como de la ruta endocítica, o bien, que las membranas que el virus utiliza para adquirir su envoltura pueden proceder de vesículas en tránsito entre el TGN y los endosomas. En este estudio también mostramos que la infección por el CMVH induce la expresión de la proteína sintaxina 3 (STX3), perteneciente a la familia de proteínas conocidas como SNAREs, donde las siglas provienen de receptores de SNAP (¿SNAP Receptors¿) y SNAP significa proteína de anclaje al NSF soluble (¿Soluble NSF-Anchorage Protein¿), siendo NSF el factor sensible a la N-etil-maleimida (¿N-ethylmaleimide sensitive factor¿). La STX3 es un componente de la maquinaria celular implicada en los procesos de fusión de membranas, y está localizada en la membrana plasmática y en el sitio de ensamblaje del CMVH, donde ha sido hallada asociada a las membranas que aparecen envolviendo los viriones, mediante estudios de inmuno-marcaje con oro. En este trabajo comprobamos que el silenciamiento de la STX3 mediante la técnica de ARN de interferencia (ARNi) redujo la producción del CMVH, mientras que la expresión de una construcción de la STX3 resistente a la inhibición mediante ARNi, aumentó la producción de este virus. Además, el examen ultraestructural del sitio de ensamblaje del CMVH en células silenciadas para la STX3 mostró que había menos viriones maduros y más virus en el proceso de envoltura. Por el contrario, el silenciamiento de la STX3 no afectó a la producción del virus herpes simplex tipo 1 (VHS-1). El mecanismo mediante el cual la STX3 influye en la morfogénesis del CMVH probablemente implica a los cuerpos multivesiculares/lisosomas dado que el silenciamiento de la expresión de la STX3 redujo a su vez la expresión de glicoproteínas de la membrana lisosomal. Los resultados de esta tesis doctoral demuestran que la proteína STX3 ejerce una función durante la morfogénesis del citomegalovirus humano, y desvelan que esta proteína SNARE desempeña un nuevo papel en relación a los compartimentos intracelulares denominados cuerpos multivesiculares/lisosomas.