The effect lateral interactions: a biophysical characterization of E. coli FtsZ lateral mutants

Resumen

La bacteria Escherichia coli (E. coli) es uno de los organismos que se utiliza para estudiar la división celular bacteriana dada su fácil reproducción y crecimiento en laboratorios. Esta bacteria, del tipo Gramnegativa, ha sido investigada exhaustivamente en los últimos veinte años intentando entender los mecanismos de su división celular. Muchas de las bacterias Gram-negativas son patógenas por lo que desarrollar nuevos fármacos capaces de controlar su proliferación es importante para curar infecciones. Gracias al meticuloso estudio realizado por varios grupos de investigación, se han identificado las proteínas y genes involucrados en la división celular de E. coli. Un complejo macromolecular constituido por al menos 10 proteínas esenciales, y otras 15 proteínas accesorias, es el responsable de dividir la bacteria. Este complejo de proteínas altamente dinámico, llamado divisoma, debe ensamblarse en el sitio donde se producirá la división de la célula bacteriana. La división se inicia con la formación del proto-anillo. Este anillo lo constituyen polímeros de la proteína FtsZ (el anillo Z) y dos proteínas asociadas a la membrana celular interna: FtsA que interacciona a través de una hélice anfipática, y ZipA que se encuentra integrada a través de una única hélice transmembrana. Dado que FtsZ se halla soluble en el citoplasma bacteriano, los polímeros necesitan interaccionar al menos con FtsA o ZipA para ser anclados a la membrana interna a través de su interacción con el carboxi-terminal de FtsZ. También se han identificado otras proteínas accesorias, aunque no esenciales, que se localizan en el sitio de división y contribuyen a la estabilización del anillo Z antes de iniciarse la constricción de ambas paredes celulares, interna y externa. FtsZ es una proteína capaz de polimerizar uniendo dos monómeros por medio de la incorporación de una molécula de nuclótido GTP. Inmediatamente después de la unión de GTP se produce la hidrólisis del nucleótido en GDP que se intercambia nuevamente por otro GTP manteniendo la unión entre monómeros estable. Esta actividad GTPasa sumada al rápido intercambio de monómeros dentro de un polímero hace que FtsZ muestre in vitro un alto polimorfismo y dinamismo bajo distintas condiciones de polimerización. Mediante técnicas de microscopía, tales como microscopía electrónica o microscopía de fuerzas atómicas, se han observado filamentos simples, dobles, curvos, rectos, circulares, en forma de espiral y planchas de polímeros asociados lateralmente, así como superestructuras del tipo cintas y toroides Dado que FtsZ exhibe in vitro este extenso polimorfismo, las preguntas inmediatas que surgen son ¿cómo se encuentran dispuestos estos polímeros dentro del anillo Z? y ¿cómo es el mecanismo de generación de fuerza necesaria para la constricción de la célula bacteriana? Para responder a estas preguntas se han realizado diversos estudios tanto in vivo como in vitro, y se han propuesto diferentes modelos de organización de los polímeros de FtsZ y de posibles mecanismos generadores de fuerza. Experimentos in vivo han mostrado que mutaciones en ciertos amino ácidos de FtsZ alteran la funcionalidad de la proteína inhibiendo la división de E. coli. Sorprendentemente, todas las mutaciones de FtsZ dirigidas a las zonas de contacto lateral entre polímeros han impedido que la bacteria se divida indicando así la importancia de las interacciones laterales para su división. A partir de datos experimentales in vitro se han propuesto diferentes modelos matemáticos de mecanismos posibles para que los filamentos de FtsZ sean contráctiles. Estos modelos se basan en cambios en la curvatura de la unión entre monómeros debido a la hidrólisis del nucleótido, interacciones laterales o restricciones en la torsión natural del filamento según su anclaje a la membrana. A pesar del extenso trabajo in vitro y del avance de la microscopía de alta resolución in vivo, no se ha llegado a un consenso sobre la disposición de los polímeros de FtsZ dentro del anillo de división así como del mecanismo molecular generador de la fuerza constrictiva. Se han propuesto como aspectos relevantes para la constricción a la curvatura y a las interacciones laterales de los filamentos de FtsZ. En esta tesis nos proponemos explorar in vitro el comportamiento de dos mutantes laterales no funcionales de FtsZ descritos previamente por Shin et al. [Shin et al., 2013], y compararlo con el de la proteína nativa mediante un sistema reconstituido en superficies in vitro. Queremos identificar qué características del comportamiento in vitro de estos dos mutantes puede asociarse a su no funcionalidad in vivo. Para caracterizar el efecto de estas mutaciones disponemos de dos técnicas biofísicas de caracterización en superficie: Microscopía de fuerzas atómicas (AFM) y Microbalanza de cuarzo (QCM). Mediante AFM estudiaremos cómo estas mutaciones laterales de FtsZ afectan la forma y dinamismo de los polímeros en mica, así como la formación de agregados en mica y en bicapas lipídicas ancladas, cuando estos filamentos están unidos a través de ZipA. Con QCM cuantificaremos la interacción de FtsZ y ZipA en bicapas lipídicas ancladas a superficies planas para compararla con las medidas disponibles en solución.