Medicinal plants from andaluciapotential use as intestinal anti-inflammatory agents

Resumen

INTRODUCCION El término Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) comprende dos patologías: la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). Ambas se caracterizan por una inflamación crónica del intestino derivada de una respuesta inmune intestinal exacerbada ante un determinante antigénico desconocido. En ambas se alternan periodos de remisión de la enfermedad con intervalos de exacerbación de los síntomas. Aunque hasta el momento se desconocen los mecanismos responsables de la iniciación y perpetuación del proceso inflamatorio intestinal, es aceptado que en su fisiopatología están implicados factores genéticos, ambientales e inmunológicos. Así, numerosos estudios han establecido que, en personas genéticamente predispuestas, una activación exagerada y descontrolada del sistema inmune intestinal frente a un determinante antigénico puede desencadenar la aparición de la respuesta inflamatoria intestinal exagerada. Esta respuesta inmunológica genera numerosos mediadores de carácter proinflamatorio (citocinas, eicosanoides y especies reactivas derivadas del oxígeno y/o del nitrógeno) que actúan de forma sinérgica y sincronizada promoviendo la amplificación y cronificación del proceso inflamatorio del intestino. Ya que no se conoce la etiología de la EII, actualmente no existe un tratamiento curativo para esta patología y los objetivos principales de la terapia farmacológica consisten en promover la remisión del ataque agudo de la enfermedad y reducir la incidencia de recurrencias. Esto se consigue inhibiendo la respuesta inmunológica exacerbada que tiene lugar tanto en EC como en CU, bien actuando sobre el mayor número posible de mediadores proinflamatorios involucrados en la patogénesis de estas enfermedades, o bien actuando en concreto sobre alguno de ellos que posea un papel relevante. Algunos de los tratamientos disponibles en la actualidad son los fármacos antiinflamatorios, los inmunosupresores, o las terapias biológicas. El 5-ASA (5-aminosalicílico) es el antiinflamatorio de elección en las fases iniciales de la enfermedad, cuando la inflamación afecta solo a una pequeña porción del colon. Cuando los pacientes presentan una patología de intensidad moderada deben pasar a tratarse con corticoides orales o en enemas como budesonida, y cuando la afectación colónica es más extensa, los pacientes no responden a budesonida o 5-ASA o presentan una enfermedad muy activa, deben recibir prednisona o esteroides parenterales. Si no se consigue controlar la actividad de la enfermedad con estos fármacos, está indicada el uso de inmunosupresores como azatioprina, metotrexato, infliximab y finalmente, en caso de fracaso fármaco-terapéutico se puede recurrir a la cirugía. Todos estos tratamientos tienen una eficacia relativa, ademas de manifestar importantes efectos adversos que limitan su utilización prolongada en el tiempo. Por ello es importante la investigación de nuevas estrategias terapéuticas que aúnen eficacia y seguridad. Distintos estudios han puesto de manifiesto la tendencia actual por parte de los pacientes con EII de emplear medicinas alternativas y/o complementarias en el tratamiento de su enfermedad, probablemente como consecuencia de la falta de eficacia que el tratamiento convencional tiene en muchas ocasiones, o por la elevada incidencia de reacciones adversas asociadas que les caracteriza. Entre las distintas terapias utilizadas destaca el empleo de plantas medicinales con propiedades anti-inflamatorias: se trata de tratamientos seguros, ya que se han venido empleando durante muchos años, y que contienen una mezcla de principios activos que podrían promover la actuación simultánea sobre distintas dianas terapéuticas del proceso inflamatorio intestinal. En la Comunidad Autónoma Andaluza existe un gran número de especies vegetales autóctonas utilizadas por la Medicina Tradicional como anti-inflamatorios y en dolencias digestivas, que requieren de su validación científica para poder ser utilizadas en el futuro para el tratamiento de pacientes con EII, bien como medicina alternativa o complementaria. OBJETIVO El presente trabajo de Tesis doctoral pretende evaluar la actividad anti-inflamatoria intestinal de distintas especies vegetales utilizadas en la medicina tradicional como anti- inflamatorias y comparar sus efectos con aquellos obtenidos con un extracto vegetal estandarizado de Thymus serpyllum (Serpylli herba) que se encuentra comercializado en la actualidad. Así, se propusieron dos objetivos principales: 1. Evaluar el efecto anti-inflamatorio intestinal de distintas dosis de Serpylli herba, Phlomis lychnitis, Phlomis purpurea, Lavandula dentata y Lavandula stoechas. Para ello, los diferentes extractos vegetales fueron administrados por vía oral en un modelo de colitis experimental inducida por ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en ratas y en el modelo del sulfato de dextrano sódico (DSS) en ratones siguiendo un protocolo curativo. 2. Establecer los mecanismos de acción involucrados en el efecto beneficioso de los extractos vegetales a través de experimentos in vitro en diferentes células implicadas en la respuesta del sistema inmune. Además se evaluó la actividad antioxidante, el efecto sobre la respuesta inmune y sobre la integridad del epitelio intestinal de los diferentes extractos. METODOLOGÍA Inicialmente, para llevar a cabo una primera aproximación a la naturaleza de los extractos, se estableció el contenido de polifenoles y la actividad antioxidante mediante del método del DPPH. Para llevar a cabo los experimentos sobre la actividad biológica, en el modelo de TNBS se siguió un protocolo de tratamiento curativo: una vez establecida la colitis tras la administración intra-rectal del TNBS, se administraron diariamente las diferentes dosis orales de los extractos durante una semana, con el objeto de controlar el proceso inflamatorio. Al final de las experiencias, los animales fueron sacrificados y el colon fue extraído en su totalidad. El daño macroscópico fue valorado en función de la relación peso/longitud del colon y una evaluación visual a la que se asignó un índice de daño macroscópico (IDM) de acuerdo con el criterio descrito por Bell y col. (1995). Para la evaluación microscópica, secciones de las muestras de colon fueron teñidas con hematoxilina eosina y los cambios histológicos fueron evaluados según el criterio establecido por Camuesco y col. (2004). Las determinaciones bioquímicas incluyeron la valoración del estado oxidativo colónico, mediante la determinación de la actividad de la enzima mieloperoxidasa (MPO), el contenido de glutation (GSH) total y la expresión proteica de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) intestinal mediante Western blot. Asimismo se valoró la producción de citocinas pro-inflamatorias como el factor de necrosis tumoral ¿ (TNF-¿) o las interleucinas (IL) -1ß e IL-6 mediante técnicas de ELISA. Finalmente, se procedió al análisis de la expresión génica, mediante PCR cuantitava y semi-cuantitativa, de distintos marcadores del proceso inflamatorio. Esto incluye citoquinas como TNF-¿, IL-1ß, IL-6, IL-17; mediadores quimiotácticos como la proteína quimio atrayente de monocitos MCP-1 (monocyte chemoatractant protein), la molécula quimio atrayente de neutrófilos inducidos por citoquina CINC-1 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant) y la proteína inflamatoria de macrófagos MIP (macrophage inflammatory protein)-2; la molécula de adhesión intercelular ICAM (inter-cellular adhesion molecule)-1, y marcadores de la función de barrera intestinal como mucinas (MUC-2 y MUC-3), trefoil factor (TFF)-3, y proteínas de las uniones estrechas del epitelio como Zonula occludens (ZO)-1. Cuando se realizaron los ensayos en el modelo del DSS se siguió también un protocolo de tratamiento curativo. Una vez desarrollada la colitis por la presencia de DSS al 2,5% en el agua de bebida durante 5 días, se administraron los distintos extractos por vía oral. Durante el desarrollo de las experiencias se controlaron diariamente una serie de parámetros generales, que incluyen el consumo diario de comida de los animales, la evolución del peso corporal, y la aparición de heces diarreicas y sanguinolentas por visualización de restos perianales. Tras el sacrificio de los animales, el colon fue extraído en su totalidad, y las alteraciones intestinales fueron caracterizadas en base a parámetros macroscópicos, microscópicos y bioquímicos, de manera similar a lo que se realizó en el modelo experimental anterior, evaluando el efecto anti-inflamatorio intestinal de los diferentes tratamientos administrados. Además en el caso de L. dentata y L. stoechas se profundizó más el estudio evaluando los efectos beneficiosos de estos extractos sobre la maduración de los macrófagos intestinales, lo cuales desempeñan un papel clave en el mantenimiento de la tolerancia de la lamina propria del colon. Se llevaron a cabo diferentes experimentos in vitro en distintas células involucrada en la respuesta inmune: línea celular de células epiteliales de carcinoma rectal de ratón (CMT-93) y de células de adenocarcinoma rectal humanas (Caco-2), macrófagos derivados de medula ósea de ratón (BMDM), células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y células dendríticas derivadas de monocitos (moDCs). Además, la EII se asocia también a la aparición de síntomas extra-intestinales y, por este motivo, podría ser considerada una patología sistémica. Estos síntomas pueden aparecen antes, simultàneamente o a posteriori del diagnóstico de la EII, y determinan un empeoramiento de la calidad de vida de los pacientes la cual ya se ve comprometida por las manifestaciones intestinales de la patología. Entre todas las manifestaciones extra-intestinales, las más comunes son las afecciones articulares, con síntomas similares a un proceso reumático. Por esto, de manera adicional, se evaluó el efecto anti-inflamatorio de los extractos de L. dentata y L. stoechas sobre edema plantar inducido por carragenina en ratones, confirmando la capacidad de estos extractos para modular la respuesta inmune también en este modelo experimental. RESULTADOS Thymus serpyllum. El extracto Serpylli herba manifestó efecto anti-inflamatorio intestinal en los dos modelos de colitis experimental utilizados: modelo experimental inducido por TNBS en ratas y el inducido por DSS en ratones. Mediante de los estudios histológicos (Figuras 14 y 17) se observó una recuperación del daño intestinal y, a través de los análisis bioquímicos, se puso de manifiesto una mejora de los diferentes marcadores del proceso inflamatorio, entre los cuales se encuentran la actividad de la MPO (Tabla 6), el contenido de glutatión total, los niveles de leucotrieno B4 (Figura 16) y la expresión enzimática de iNOS y COX-2 (Figura 15). Este efecto beneficioso estuvo asociado a una reducción de la expresión de distintas citoquinas como TNF-¿, IL-6, IL-1ß, IFN-¿ e IL-17, la quimocina MCP-1 y la molécula de adhesión ICAM-1 (Figuras 16 y 18), mejorando así la respuesta inmune alterada asociada a la inflamación del colon. Por todo ello, podemos concluir que Serpylli herba posee un efecto anti-inflamatorio en diferentes modelos de colitis experimental que podría ser atribuido a sus propiedades moduladoras de la respuesta inmune. Phlomis lychnitis y Phlomis purpurea. Los análisis histológicos (macroscópicos y microscópicos) (Figura 20) de las muestras de colon evidenciaron que los extractos de Phlomis lychnitis y Phlomis purpurea ejercen un efecto anti-inflamatorio que ha sido confirmado bioquímicamente a través de una disminución de la actividad de la MPO (Tabla 7), que es un marcador de la infiltración de neutrófilos, un aumento del contenido de glutation total, que contrarresta el estrés oxidativo asociado al proceso inflamatorio, y una reducción de la expresión de la iNOS (Figura 21). Sin embargo, solo el extracto de Phlomis purpurea redujo la expresión de las citocinas pro-inflamatorias IL-1ß e IL-17 (Figura 22), las quimocinas CINC-1 y MCP-1, así como también la molécula de adhesión ICAM-1 (Figura 23), mejorando la respuesta inmune alterada asociada a la inflamación colónica. Además, tanto Phlomis lychnitis como Phlomis purpurea fueron capaces de incrementar significativamente la expresión de marcadores de la integridad del epitelio intestinal como MUC-2, MUC-3 y villin (Figura 24), poniendo de manifiesto una mejora de la permeabilidad del colon que se encuentra alterada en la inflamación intestinal. Ambos extractos manifiestan actividad en el modelo de colitis experimental inducido por TNBS, estableciendo una base experimental que sustenta sus usos tradicionales en desordenes digestivos. Además de sus propiedades anti-oxidantes, otros mecanismos pueden contribuir al efecto beneficioso, como la mejora de la función barrera del epitelio intestinal y una reducción de la respuesta inmune. Lavandula dentata y Lavandula stoechas. Los extractos de L. dentata y L. stoechas revelaron propiedades inmunomoduladoras en experimentos in vitro, llevados a cabo en distintos tipos celulares involucrados en la respuesta inmune. Ambos extractos redujeron la producción de diferentes mediadores de la inflamación como citocinas y óxido nítrico. Además, manifestaron efecto anti-inflamatorio intestinal en el modelo de colitis experimental inducido por TNBS en ratas, reduciendo los niveles de MPO e incrementando el contendido total de glutatión (Tabla 9), indicando una disminución de la infiltración de neutrófilos y una mejora del estado oxidativo. Asimismo, ambos extractos modularon la expresión de citocinas pro-inflamatorias y quimiocinas mejorando la alteración de la función barrera del epitelio intestinal (Figuras 34 y 35). Los extractos de L. dentata y L. stoechas mostraron efecto anti-inflamatorio en otro modelo experimental, el edema plantar inducido por carragenina en ratones, donde se pudo observar una disminución significativa del grosor de las patas. Este efecto se acompañó con una reducción de la expresión de diferentes enzimas inducibles como MMP-9, iNOS y COX-2 , asi como citoquinas pro-inflamatorias (Figura 40). Es importante destacar que ambos extractos fueron capaces de influir en el proceso de diferenciación de los macrófagos intestinales, que se encontraba alterado en la inflamación inducida por DSS en ratones. Los macrófagos intestinales, gracias a sus propiedades anti-inflamatorias, contribuyen al mantenimiento de la tolerancia intestinal, asi, los tratamientos con los extractos de L. dentata y L. stoechas fueron capaces de favorecer la diferenciación de dichos macrófagos, manifestando entonces su actividad anti-inflamatoria (Figura 39). En conclusión, ambos extractos presentan efecto anti-inflamatorio intestinal, confirmando, nuevamente, sus potenciales usos como remedios naturales en patologías digestivas. Asimismo, sus efectos beneficiosos se manifiestan también en la inflamación articular sugiriendo una posible utilización para el tratamiento de los síntomas extra-intestinales de la EII. CONCLUSIONES 1. Serpylli herba manifestó efecto anti-inflamatorio intestinal en dos modelos experimenales de colitis; su efecto podría ser atribuido a sus propiedades inmunomoduladoras. 2. Los extractos de Phlomis lychnitis, Phlomis purpurea, Lavandula dentata y Lavandula stoechas presentaron actividad anti-inflamatoria intestinal en el modelo de colitis experimental inducida por TNBS en ratas. Los resultados obtenidos fueron similares a los logrados con el extracto estandarizado de Serpylli herba. Esto confirma su uso tradicional como anti-infamatorios en desordenes del trato gastrointestinal y demuestra su potencial desarrollo como agentes anti-inflamatorios para el tratamiento de la EII. 3. Además de sus propiedades antioxidantes, otros mecanismos pueden contribuir a este efecto beneficioso, como una mejora de la barrera epitelial intestinal y una reducción de la respuesta inmune. Todos los extractos han demostrado poseer un efecto inmunomodulador directo en diferentes tipos celulares. En particular, Lavandula dentata y Lavandula stoechas fueron capaces de mejorar la maduración de los macrófagos residentes del intestino y podrían interferir en la presentación del antígeno de las DCs a las células T. Esta inmunomodulación podría contribuir a una mejora del proceso inflamatorio que caracteriza la EII