Desarrollo y caracterización de aptámeros de rna y dna frente a la proteína erbb3 binding protein-1 mediante procedimientos de selección y evolución in vitro

Resumo

El principal objetivo de esta Tesis ha sido el desarrollo y caracterización de aptámeros específicos frente a la proteína ErbB3 binding protein-1 (Ebp1). Los aptámeros, de DNA y RNA, se obtuvieron mediante selección in vitro y evolución in vitro. Las poblaciones finales de los cuatro procesos se analizaron y compararon para detectar y caracterizar los mejores aptámeros, así como para evaluar las estrategias utilizables para la obtención de los mismos. Los aptámeros son moléculas de DNA de cadena sencilla o de RNA, seleccionadas a partir de poblaciones combinatoriales mediante un proceso conocido como SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment), que son capaces de unirse específicamente a un ligando determinado. En comparación con otras moléculas de unión (naturales o sintéticas) los aptámeros poseen propiedades químicas y bioquímicas únicas, entre las que destaca la posibilidad de ser seleccionados frente a cualquier tipo de diana, incluso en condiciones no fisiológicas. Desde la aparición de la tecnología SELEX, en 1990, se han obtenido numerosos aptámeros con alta especificidad y afinidad frente a un amplio rango de moléculas diana, entre ellas proteínas, ácidos nucleicos y complejos macromoleculares de gran relevancia en virología. En este trabajo se han desarrollado aptámeros frente a ErbB3 binding protein-1 (Ebp1), una proteína ITAF (IRES-trans acting factor) también conocida ITAF45 y PA2G4, que estimula la traducción de la poliproteína del virus de la fiebre aftosa (FMDV) mediante su unión al IRES viral. Los principales objetivos de esta Tesis fueron: I) Obtener aptámeros de ssDNA y de RNA frente a la proteína Ebp1, comparando los procesos de selección in vitro de ambos ácidos nucleicos (DS, RS) con los de evolución in vitro (DE, RE), realizados en paralelo; II) Combinar la especificidad de los aptámeros por sus dianas con la sensibilidad de la amplificación de ácidos nucleicos mediante PCR a tiempo real para conseguir un método de detección ultrasensible basado en el ELONA-qPCR; III) Aplicar el sistema de ELONA-qPCR desarrollado a la caracterización funcional (incluyendo la cuantificación de la constante de disociación, Kd, y la capacidad de unión máxima, Bmax) de los aptámeros obtenidos; IV) Identificar motivos cortos de secuencia/estructura presentes en los aptámeros de alta afinidad que podrían estar implicados en la interacción aptámero- Ebp1; y V) Realizar una caracterización preliminar de la estructura tridimensional del IRES de FMDV, de Ebp1 y de complejos IRES-Ebp1 mediante microscopía de fuerza atómica (AFM).