Validación y explotación de enzimas del metabolismo de nucleótidos como dianas terapéuticas en plasmodium

Resumen

La necesidad de nuevos fármacos para el tratamiento de la malaria es incuestionable. El problema acuciante de la aparición de resistencias y la escasa variedad en la estructura y modo de acción de los fármacos en uso constituyen grandes limitaciones para el tratamiento de una enfermedad para la que una vacuna aún no está disponible. La biosíntesis de nucleótidos ha sido satisfactoriamente explotada en el diseño de nuevos tratamientos para diferentes enfermedades que van desde el cáncer a infecciones víricas. En el caso de Plasmodium falciparum la síntesis e interconversión de nucleótidos púricos y pirimidínicos exhibe una serie de particularidades que tienen un elevado potencial terapéutico. Con estas consideraciones en mente, uno de los objetivos centrales de esta tesis fue analizar el papel de distintas enzimas del metabolismo de nucleótidos en la superviviencia y proliferación celular. Por otra parte, el potencial de una colección singular de extractos de productos naturales ha sido explorado con el fin de identificar nuevos cabezas de serie con actividad antiparasitaria. Se ha utilizado una aproximación basado en la utilización de potenciales dianas enzimáticas utilizando técnicas de cribado de alto rendimiento. Las colecciones de extractos microbianos de la Fundación MEDINA junto con la existencia de una tecnología singular han permitido analizar por primera vez frente a Plasmodium un número de productos naturales sin precedentes. Los objetivos específicos propuestos durante el desarrollo del trabajo han sido: 1. Establecer el papel de la PfdUTPasa y PfTMPK en la supervivencia celular mediante la obtención de parásitos knockout. 2. Evaluar la inhibición de la PfdUTPasa de Plasmodium por compuestos análogos de sustrato, los derivados tritilados de uridina. 3. Esclarecer el papel desempeñado por la PfdUTPasa en el modo de acción y efecto antimalárico de inhibidores tritilados derivados de uridina. 4. Optimizar e implementar un protocolo de HTS para el descubrimiento de productos naturales inhibidores de las enzimas PfPNP y PfTMPK utilizando las colecciones de extractos microbianos de la Fundación Medina. 5. Establecer la distribución intracelular y del patrón de expresión de las enzimas PfdUTPasa, PfDHFR-TS y PfTMPK en células de Plasmodium falciparum a lo largo del ciclo intraeritrocítico. La metodología utilizada incluye el cultivo y la manipulación genética de Plasmodium falciparum para el estudio de las enzimas PfTMPK y PfdUTPasa como dianas terapéuticas así como para la valoración de la capacidad inhibitoria del crecimiento de los diferentes compuestos ensayados a lo largo de esta tesis. Además, se ha llevado a cabo la purificación de proteínas y diversos ensayos enzimáticos tanto en formato de placa de 384 pocillos como en sistema stopped flow. En relación con los resultados, se pueden englobar en tres grandes grupos: (i) la validación de PfdUTPasa y PfTMPK como dianas terapéuticas, (ii) la búsqueda y estudio de compuestos inhibidores de PfPNP, PfTMPK y PfdUTPasa y (iii) la localización celular y la evolución de la expresión a lo largo del ciclo intraeritrocítico de las enzimas implicadas en la síntesis de timidilato: PfdUTPasa, PfDHFR-TS y PfTMPK. Con respecto a la validación de PfdUTPasa y PfTMPK, la estrategia planteada para el reemplazamiento génico ha sido semejante para ambas enzimas. La sustitución de la secuencia endógena por una copia truncada en su extremo 3¿ no fue posible mientras que construcciones que mantienen intacto el extremo 3¿, aun modificando la 3¿ UTR, se recombinaron de forma eficiente en el locus original. Estas observaciones indican que el proceso de recombinación es factible pero sólo se generan parásitos viables cuando se mantiene la secuencia codificante intacta. Una vez demostrado que el locus génico es reemplazable y que la estrategia de reemplazamiento ha tenido éxito, está comúnmente aceptado el que la imposibilidad de obtener parásitos viables se interpreta como una evidencia sólida de que el gen es esencial. La disponibilidad de inhibidores específicos permitió abordar en Plasmodium la validación química de la dUTPasa como diana terapéutica. La sobreexpresión de la PfdUTPasa produce un incremento en la IC50 de más de 3.5 veces para dos de los compuestos estudiados, lo que corrobora que la enzima es la diana molecular en el interior celular. Por otra parte el descenso en los niveles de dTTP e incremento en los de dUTP tras la exposición a los inhibidores también apoyan el modo de acción y el papel clave de la dUTPasa en la generación de dTTP dentro de la célula. Se han puesto a punto ensayos para la identificación de compuestos inhibidores de las enzimas PfPNP y PfTMPK a partir de una parte de la colección de productos naturales de la Fundación MEDINA. En el caso de PfPNP, el screening ha permitido la identificación de inhibidores novedosos con valores de IC50 en el rango micromolar. Esta potencia se correlaciona con la que exhiben frente al parásito en cultivo Mientras que el metabolismo de pirimidinas ha sido extensamente estudiado en Plasmodium como blanco de acción de fármacos, se desconocen muchos aspectos de la localización intracelular de esta ruta metabólica y cómo tiene lugar el transporte de intermediarios hacia el interior de los distintos compartimentos, entre ellos el núcleo. La distribución intracelular de las enzimas PfdUTPasa, PfDHFR-TS y PfTMPK se evaluó mediante microscopía de fluorescencia de célula viva expresando las proteínas fusionadas con GFP. Las tres enzimas han mostrado una localización principalmente citosólica, estando también presentes en núcleo y mitocondria. En cuanto a la distribución temporal de estas enzimas, los resultados obtenidos indican que a lo largo del ciclo intraeritrocítico la expresión de dUTPasa y TMPK es máxima en trofozoítos y esquizontes, estadios donde se da la replicación activa del DNA del parásito. Para la PfDHFR-TS, la máxima expresión se da en el estadío de esquizontes. Las conclusiones extraídas del trabajo realizado en esta tesis son: 1. Los estudios genéticos llevados a cabo con la PfdUTPasa y la PfTMPK sugieren que ambas enzimas catalizan procesos esenciales para la progresión del ciclo intraeritrocítico de Plasmodium falciparum. 2. La PfdUTPasa tiene un papel relevante en el efecto antiparasitario observado para determinados inhibidores de la enzima. 3. La PfdUTPasa tiene un papel esencial en la síntesis de timidilato y su inhibición genera un descenso en el pool de dTTP así como un aumento en el de dUTP. 4. La implementación de un protocolo para el cribado de alto rendimiento frente a la PNP es una estrategia válida para el descubrimiento de nuevos inhibidores de esta enzima. Así, se han identificado dos series novedosas desde el punto de vista estructural con actividad frente a la enzima en el rango micromolar y que además presentan actividad antiparasitaria. 5. El estudio de la localización de las enzimas PfdUTPasa, PfDHFR-TS y PfTMPK mediante microscopía de fluorescencia ha puesto de manifiesto que se localizan mayoritariamente en el citosol, aunque también se sitúan en menor proporción en núcleo y mitocondria. 6.. La expresión de las enzimas del metabolismo de pirimidinas PfdUTPasa, PfDHFR-TS y PfTMPK está modulada a lo largo del ciclo intraeritrocítico en Plasmodium falciparum. La máxima expresión de proteína está vinculada a los estadíos donde se produce la replicación más activa del DNA.