Desarrollo y validación de un sistema diagnóstico rápido para la detección de alteraciones cromosómicas que provocan infertilidad en caballos basado en herramientas moleculares

Resumen

El sector equino ejerce un importante impacto en la economía de España representando el 0,51% del PIB nacional. La venta de cubriciones y semen suponen uno de los principales ingresos económicos de ésta actividad por lo que, para la rentabilidad del sector, es importante que la población de reproductores presente la máxima fertilidad posible. Las anomalías cromosómicas sexuales se consideran una de las principales causas de infertilidad en la especie equina. Entre ellas destacan aquellas que afectan al par cromosómico sexual (ECAX y ECAY), especialmente el síndrome de Turner, síndrome de sexo reverso y el quimerismo celular, que pueden constituir hasta el 95% de las alteraciones en esta especie y abarcan el mayor número de casos reportados hasta la fecha. Los animales portadores de estas patologías suelen presentar una apariencia externa y comportamental normal en edades tempranas dificultando su diagnóstico. Sin embargo, tras la pubertad, comienzan a manifestar anomalías reproductivas como esterilidad o hipoplasia gonadal. Adicionalmente el elevado coste y dificultad de las técnicas clásicas para el diagnóstico de las alteraciones cromosómicas hace que muchos de los casos queden sin diagnosticar provocando que la prevalencia real quede infraestimada. Muy recientemente las técnicas de tipo molecular se han comenzado a utilizar como soporte a las técnicas citogenéticas en el diagnóstico de alteraciones de tipo cromosómico en humanos y animales de producción ganadera Entre éstas, los marcadores de tipo microsatélite (STR) han mostrado su utilidad de forma satisfactoria. Debido a esto, hemos desarrollado e implementado una nueva herramienta de diagnóstico molecular económica y sencilla que permite la detección de las principales alteraciones cromosómicas asociadas con infertilidad en caballos (CAPITULO 4). Para ello, se combinaron en un único panel diagnóstico, 6 marcadores STR en los cromosomas X (LEX026, LEX003, TKY38, TKY270 y UCDEQ502) e Y (EcaYH12) de caballo, y se añadió el análisis de la presencia o ausencia del gen SRY con el fin de caracterizar de una manera precisa éste tipo de alteraciones genéticas. Las frecuencias de los marcadores STR utilizados se caracterizaron en una población de 271 caballos de Pura Raza Español (PRE) para determinar la eficiencia del método como herramienta diagnóstica. Los resultados demostraron que todos los microsatélites son altamente polimórficos presentando un elevado número de alelos (Contenido de Información Polimórfica > 0,5). Basada en esta variabilidad se ha estimado una sensibilidad de 100% y una especificidad superior al 90% en el diagnóstico del síndrome de Turner, síndrome de sexo reverso y el quimerismo celular. Por último, el método molecular se validó utilizando para ello 10 animales con alteraciones cromosómicas previamente diagnosticados mediante técnicas citogenéticas con un 100% de eficiencia. Mediante el uso de éste panel junto con otras técnicas asociadas (citogenética clásica, citogenética molecular (FISH), test de paternidad basados en STRs, etc.) hemos descrito el primer caso a nivel mundial de un quimerismo hematopoyético 64XY/63X0 en el que una de las líneas celulares era cromosómicamente anormal (CAPITULO 2). Además, durante el desarrollo de la presente tesis, hemos diagnosticado 15 animales con quimerismo sanguíneo 64XX/64XY, demostrando que son reproductivamente normales (CAPITULOS 1 y 5), y cuatro nuevos casos de yeguas sexo reverso 64,XY SRY negativo (CAPITULO3). Este nuevo panel de marcadores moleculares podría utilizarse como herramienta complementaria en los programas de cría para determinar la presencia de individuos portadores de anomalías cromosómicas de una manera precoz lo que supondría un elevado ahorro de tiempo y esfuerzo para veterinarios y ganaderos.