Caracterización y regulación del complejo kv1.5-kvbeta1.3

Resumen

Los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) son proteínas de membrana involucradas en diversos procesos fisiológicos y fisiopatológicos. De hecho, el funcionamiento electrofisiológico normal del corazón está determinado por la propagación ordenada de potenciales de acción (PA) generados en miocitos individuales. Por lo tanto, anomalías en la génesis, propagación, duración o configuración de estos PA constituyen la causa de arritmias cardíacas. Las corrientes de K+ determinan la repolarización del PA cardíaco, el potencial de membrana, el ritmo cardíaco, la refractariedad del tejido cardíaco y, por tanto, constituyen importantes dianas moleculares para la acción de diversos moduladores de la función cardíaca. Los canales Kv1.5 son los principales responsables de la génesis de la corriente de salida ultrarápida de potasio (IKur) y, debido a que se expresan mayoritariamente en aurícula, la IKur determina la duración del PA auricular. Así, estos canales representan una diana farmacológica para el desarrollo de fármacos útiles en el tratamiento de arritmias supraventriculares. Estos canales se ensamblan con diversas subunidades Kvß. En particular, las subunidades Kvß1.3 modifican las características electrofisiológicas de los canales Kv1.5, induciendo una inactivación rápida y parcial, un mayor grado de inactivación lenta, un desplazamiento de la curva de activación hacia potenciales más electronegativos, y una disminución en la sensibilidad del canal al bloqueo inducido por fármacos. Tras inhibir la PKC con calfostina C los canales Kv1.5-Kvß1.3 generan corrientes de pequeña magnitud y sin inactivación rápida inducida por la Kvß1.3. En esta Tesis Doctoral hemos investigado los mecanismos subyacentes a este fenómeno utilizando técnicas electrofisiológicas y de imagen en sistemas heterólogos (células HEK293) y en tejidos nativos (miocardio de rata y humano). Los resultados obtenidos demuestran la existencia de un canalosoma funcional de Kv1.5, estrechamente regulado por PLC y PIP2, y constituido por, al menos, Kvß1.3, el receptor de quinasas C activadas (RACK1), PKCßI, PKCßII, y PKC¿ en células HEK293. En este canalosoma, las subunidades Kvß1.3 parecen tener un papel `conector¿ entre Kv1.5 y RACK1 y, por tanto, con el resto de componentes del mismo. Un canalosoma Kv1.5 muy similar se encontró en ventrículo de rata pero no en aurícula. La inhibición de PKC inducida por calfostina C también modifica la inactivación dependiente de voltaje de los canales Kv1.5-Kvß1.3, así como sobre su farmacología que resulta ser más similar a la de Kv1.5. De hecho, los valores de IC50 para bupivacaína y quinidina fueron similares a los obtenidos para el bloqueo de Kv1.5. Dado que la inhibición de la PKC disminuye la magnitud de las corrientes generadas por los canales Kv1.5-Kvß1.3, estudiamos el reciclaje de los canales Kv1.5-Kvß1.3. Observamos que la inhibición de la PKC promueve una reducción de la densidad de canales Kv1.5 en membrana y un aumento de los canales internalizados sin modificar la cantidad total de los mismos. Experimentos en los que transfectamos Rab11 constitutivamente activo demostraron que PKC está involucrada en el reciclaje lento de los canales Kv1.5-Kvß1.3 mediado por Rab11. Por último, analizamos el papel funcional de la proteína Lgi1, que interfiere con la inactivación rápida inducida por Kvß1 sobre los canales Kv1 y que ha sido relacionada con ciertos tipos de epilepsia. Tras demostrar su expresión en el tejido cardíaco de rata, con un patrón de expresión similar a Kvß1.3, demostramos que Lgi1 anula la inactivación rápida inducida por Kvß1.3, tanto tras transfectar Lgi1, como tras añadirla a la solución interna de la pipeta; lo que se acompañaba de una disminución en la cantidad de canal en la membrana celular y de modificaciones del citoesqueleto. Además, demostramos que el patrón de expresión de Lgi1 es muy similar al de Kv1.5 en el ventrículo humano, lo que nos lleva a proponer a Lgi1 como un nuevo e importante modulador del complejo Kv1.5-Kvß1.3.