Papel protector de los agonistas de receptores activados por el proliferador de peroxisomas (ppar)-beta/delta sobre el desarrollo de hipertensión

Resumen

Papel protector de los agonistas de receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR)-beta/delta sobre el desarrollo de hipertensión. El PPAR es una factor de transcripción activado por ligando que pertenece a la superfamilia de receptores hormonales nucleares. En ausencia de ligando, el receptor está unido a correpresores. Cuando se activa por unión a su ligando forma un heterodímero con el receptor RXR (retinoico), reconoce secuencias PPRE (elemento de respuesta del proliferador de peroxisomas), espercíficas de los promotores de algunos genes, activando su transcripción. Existen 3 tipos: PPARalfa, PPARgamma y PPARß. Son muy conocidos sus efectos metabólicos, por ello, los fibratos (agonistas PPARalfa) se emplean para el tratamiento de dislipemias, y las tiazolidindionas (agonistas PPARgamma) para el tratamiento de diabetes tipo 2. Ligandos PPARß son muy eficaces en la regulación del metabolismo lipídico, están actualmente en fase de ensayos clínicos para el tratamiento de dislipidemias, dirigidos especialmente a personas con bajos niveles de HDL y síndrome metabólico. Inicialmente se creía que los PPARs regulaban los genes que participan sólo en el metabolismo lipídico y glucídico. En los últimos años, se sugiere que la activación del PPARalfa o PPARgamma puede ejercer una protección cardiovascular más allá de sus efectos metabólicos. Los resultados muestran un perfil cardiovascular favorable debido a sus efectos antiateroscleróticos, antiinflamatorios y vasodilatadores, y a su capacidad para inhibir la proliferación de las CMLV y endoteliales, para reducir la hipertrofia cardíaca, para inhibir la agregación plaquetaria y para disminuir la presión arterial. Los agonistas PPARalfa o PPARgamma ejercen efectos antihipertensivos en humanos y modelos animales con o sin trastornos metabólicos. Sin embargo, aunque el subtipo ß sea el PPAR más ampliamente expresado en los tejidos humanos, su papel fisiológico y fisiopatológico es menos conocido. Pero menos aún se conoce acerca de sus acciones cardiovasculares. Debido al papel terapéutico prometedor de los agonistas PPARß y a la relativa falta de conocimiento de las acciones de los PPARß en el territorio vascular, en este estudio se investigaron los efectos a corto plazo del L165041, agonista potente y de baja selectividad de PPARß, y del GW0742, agonista selectivo y potente de PPARß. Por todo ello, el primer objetivo de esta Tesis Doctoral es analizar los efectos de agonistas PPARß sobre el tono vascular en anillos aórticos aislados de rata, centrándonos en el papel del endotelio y del NO, y sus efectos sobre la expresión y la fosforilación de la eNOS en HUVECs. Para ello realizamos medidas de reactividad vascular, por baño de órganos, medimos el NO por fluorescencia con DAF (sensible al NO) en HUVEC y analizamos la expresión proteica por western blot. La adición de Phe al baño de órganos produjo una vasoconstricción sostenida de la aorta. La posterior adición de L165041 ó GW0742, que añadimos a las concentraciones esperadas en el plasma a dosis terapéuticas, provocó una relajación concentración-dependiente que alcanzó el estado de equilibrio a los 15 min, lo que sugiere que el efecto es independiente de los procesos nucleares, ya que no habría suficiente tiempo para la transcripción de genes. La eliminación mecánica del endotelio redujo significativamente el efecto vasodilatador de ambos agonistas. La vasodilatación dependiente de endotelio es casi por completo debida a la liberación de NO. Por ello, en anillos aórticos con endotelio funcional, la inhibición de la eNOS con L-NAME redujo la relajación inducida por ambos agonistas, lo que sugiere que esta respuesta vasodilatadora está relacionada con el NO derivado de endotelio. La presencia del antagonista PPAR gamma, GW9662, no modificó las respuestas relajantes, tanto del L165041 como del GW0742 en arterias intactas precontraídas con Phe. Sin embargo, el antagonista PPARß, GSK0660, inhibió significativamente estos efectos relajantes en arterias con endotelio funcional, no teniendo efecto en los anillos de aorta sin endotelio. Por tanto, estos resultados sugieren que los efectos de L165041 y GW0742 se deben a la activación de PPARß. Por otra parte, los agonistas PPARß aumentaron la producción de NO en HUVECs. En condiciones normales de estrés oxidativo, como es el caso de nuestros experimentos, la relajación vascular dependiente de endotelio puede estar mediada por: i) Un aumento de la producción de NO endotelial. ii) La potenciación de la vía del NO-cGMP que conduce a una vasodilatación. Este mecanismo fue descartado ya que ni L165041 ni GW0742 modificaron la respuesta relajante inducida por el donador de NO, NPS, en anillos sin endotelio. Los agonistas PPARß relajaron los anillos aórticos con endotelio intacto precontraídos con el análogo del tromboxano A2, U46619. Estos efectos relajantes fueron inhibidos por la eliminación del endotelio vascular. La relajación dependiente de endotelio inducida por L165041 ó GW0742 en los anillos precontraídos con U46619 no se vio afectada por la eliminación del calcio extracelular. Por otra parte, la incubación de los anillos aórticos en solución Krebs libre de calcio que contiene un quelante intracelular de calcio, BAPTA-AM, no modificó significativamente las relajaciones dependientes de endotelio inducidas por ambos agonistas. El NO se forma en el endotelio a través de la conversión metabólica de L-arginina en L-citrulina, reacción catalizada por la eNOS. La activación de eNOS es generalmente un proceso calcio-dependiente. El aumento de la concentración de calcio intracelular libre, permite la unión de calcio-calmodulina a la eNOS, desplazando a la caveolina-1 y activando la eNOS. En nuestro estudio, observamos que los agonistas PPARß inducían una vasodilatación dependiente de endotelio, independientemente de los cambios en la concentración de calcio intracelular, ya que la eliminación de calcio extracelular o bien la incubación con el quelante de calcio intracelular, BAPTA, no alteraron el efecto relajante. Estos agentes provocan la activación de la eNOS a través de la vía PI3K/AKT, que recientemente se ha demostrado que fosforila la eNOS y altera su sensibilidad al calcio. La incubación de los anillos de aorta con el inhibidor de PI3K, LY-294002, disminuyó significativamente la respuesta relajante inducida por ambos agonistas de PPARß. Estos resultados sugieren que estos agentes podrían activar la eNOS por una vía sensible a PI3K e independiente de calcio. La exposición de HUVECs al ionóforo de calcio A23187 aumentó significativamente la intensidad de fluorescencia de DAF-2 en comparación con las células control. Este aumento no se vio afectado por el inhibidor de PI3K, LY-294002. Del mismo modo, L165041 ó GW0742, de manera concentración y tiempo-dependientes, aumentaron la producción de NO sensible al L-NAME en HUVECs. Esta producción de NO se redujo en parte por el inhibidor de PI3K, LY-294002, y por GSK0660 y no se vio afectada por GW9662. Además, en HUVECs observamos un aumento de la fosforilación de AKT y eNOS a los 15 minutos, y esta fosforilación se inhibió por LY-294002, demostrando que la activación de eNOS inducida por estos agonistas está mediada por la activación de la vía PI3K/AKT. Es importante señalar que estos compuestos podrían modificar el tono vascular, actuando tanto sobre la capa de células endoteliales como la de las células del músculo liso vascular, ya que a concentraciones elevadas, inhiben la respuesta contráctil inducida por Phe o U46619 en aortas sin endotelio. El bloqueo de PPARß con el antagonista GSK0660 no alteró la respuesta vasodilatadora de ambos agonistas en anillos de aorta sin endotelio precontraídos con Phe, lo que sugiere que estos efectos relajantes son independientes de la activación del receptor. Las altas concentraciones de estos agonistas PPARß podrían inhibir directamente el aparato contráctil o la señalización inducida por los agentes vasoconstrictores en el músculo vascular. En conclusión, nuestro estudio describe por primera vez que los agonistas PPARß, L165041 y GW0742, producen un efecto rápido en el tejido vascular de rata que conduce a una vasodilatación concentración-dependiente. Este efecto parece estar relacionado, en parte, con la activación de receptores PPARß a través de mecanismos no genómicos. La relajación es principalmente dependiente de endotelio y NO y no está relacionada con la clásica vía calcio/calmodulina para la activación de eNOS, sino con su fosforilación por la vía PI3K/AKT. El componente residual independiente de endotelio tampoco se ve afectado por la eliminación de calcio extracelular, y parece no estar relacionado con la activación de PPARß. La hipertensión es un factor de riesgo para el desarrollo y la aceleración de la aterosclerosis. El estrés oxidativo y la inactivación del NO por el O2.- juegan un papel crítico en la patogénesis de la enfermedad vascular, como la hipertensión. Su función más allá de sus efectos metabólicos no se conoce demasiado. Recientemente, se han descrito distintas acciones a nivel vascular como la inducción de la proliferación de células endoteliales, angiogénesis, vasculogénesis, inhibición de la proliferación y migración de células de músculo liso vascular, inhibición de la aterosclerosis acelerada por Ang II y la protección de las células endoteliales de la apoptosis inducida por H2O2. La activación de PPARß también exhibe propiedades antiinflamatorias en la pared vascular por la inhibición expresión de VCAM-1 y MCP-1. Por otra parte, la administración oral del agonista PPARß, GW0742, reduce la aterosclerosis en ratones knockout de LDLR -/- y atenúa la aterosclerosis acelerada por Ang II y la inflamación arterial y expresión de genes aterogénicos. Agonistas PPARß también inducen efectos vasodilatadores en aortas aisladas y arterias mesentéricas y pulmonares. Además, agonistas PPARß reducen la hipertrofia cardíaca y la presión sistólica ventricular en un modelo experimental de hipertensión arterial pulmonar inducida por hipoxia crónica. Todo ello justifica el segundo objetivo de esta Tesis Doctoral: estudiar los efectos del tratamiento crónico con el agonista PPARß, GW0742, sobre la presión arterial, la función endotelial y la inflamación vascular en ratas espontáneamente hipertensas, donde hay una gran participación de la vía de la Ang II. De acuerdo con los efectos vasodilatadores que describimos para los agonistas PPARß, pensamos que podrían presentar un efecto antihipertensor. La administración de GW0742 durante 5 semanas produce una disminución progresiva de la presión sistólica en un 11 % y la frecuencia cardíaca en un 8 % al final del tratamiento, sin efecto en ratas WKY (factor de riesgo independiente de la morbilidad y mortalidad cardiovascular en pacientes hipertensos). La presión arterial elevada de manera sostenida es una de las principales causas en el desarrollo de hipertrofia cardíaca y renal. El tratamiento crónico con GW0742 redujo significativamente el remodelado vascular en las arterias mesentéricas, sugiriendo que este efecto podría contribuir a reducir la presión sanguínea. La falta de efectos inhibitorios de GW0742 sobre la hipertrofia cardíaca, a pesar de la reducción de la presión arterial, podría explicarse por el hecho que la bajada de presión arterial sistólica no se mantuvo durante el tiempo necesario como para inducir regresión morfológica. En aorta y riñón de animales SHR, la expresión de PPARß está incrementada en comparación con WKY, lo que sugiere que los cambios en la expresión de PPAR pueden desempeñar un papel compensatorio en los vasos sanguíneos y los riñones de SHR, ya que el tratamiento crónico con GW0742 revierte estos cambios. Sin embargo, a pesar del aumento de la expresión del receptor en aorta o riñón, la expresión de sus genes diana estaba disminuida. Esto podría estar relacionado con una escasa captación de ligandos endógenos de PPARß (por ejemplo, ácidos grasos) en SHR, ya que son animales genéticamente deficientes en CD36, un transportador de membrana de ácidos grasos. Por el contrario, el mRNA de PPARß y de su gen diana, PDK4, estaba significativamente reducido en los corazones de SHR, lo que está en relación con la reducción de la oxidación de los ácidos grasos durante el desarrollo de hipertrofia cardíaca. GW0742 también revirtió este cambio en el corazón y aumentó el mRNA de PDK4 en ambas cepas de ratas. El peso de las ratas se incrementó en WKY y SHR control después de 5 semanas. El tratamiento con GW0742 redujo significativamente la ganancia de peso corporal y de la relación grasa visceral/peso corporal al final del tratamiento sólo en ratas WKY, en comparación con las ratas control. Este efecto parece no estar relacionado con cambios en la alimentación y la bebida de agua, ya que no se vieron afectados por GW0742. El PVI y PVI/PCo y PR/PC fueron mayores en el grupo SHR control en comparación con el grupo WKY control. GW0742 no reduce PVI/PCo ni PR/PC en SHR a pesar de su efecto antihipertensivo. Por otra parte, GW0742 aumentó PR/PC en WKY, posiblemente como resultado de la reducción de peso corporal. Sin embargo, a pesar de la falta de cambios macroscópicos, GW0742 redujo tanto el aumento de diámetro de los cardiomiocitos como la acumulación de colágeno en SHR, indicando que el tratamiento crónico con el agonista previene las consecuencias histopatológicas de la hipertensión. La evaluación histopatológica del corazón mostró que tanto la longitud de la fibra cardíaca como la expresión de genes de calcineurina, un marcador de la hipertrofia cardíaca, se incrementaron en SHR y GW0742 los redujo. La tinción tricrómica de Masson (contenido de colágeno de tipo I) se incrementó también en SHR en comparación con WKY, y se redujo con el tratamiento GW0742. El análisis histológico de los riñones no mostró alteraciones evidentes entre los grupos. Cuando comparamos las ratas WKY control, con ratas SHR control se vieron alteraciones estructurales en las pequeñas arterias mesentéricas, como un aumento significativo de AMT (89 %) y M/L (74 %). El tratamiento con GW0742 no tuvo efecto sobre los parámetros morfológicos de los vasos mesentéricos en WKY, pero redujo significativamente todas estas alteraciones estructurales en SHR. La relación M/L mostró una buena correlación con la presión sistólica entre los diferentes grupos. Los niveles plasmáticos de MDA, un marcador de la peroxidación lipídica, y la excreción urinaria a las 24h de iso-PGF2¿, un marcador específico de la producción sistémica de O2.-, fueron mayores en SHR en comparación con las ratas normotensas. El tratamiento con GW0742 sólo redujo significativamente estos parámetros en SHR, sin provocar efecto en ratas WKY. La finalidad de las células del músculo liso vascular es mantener un fenotipo contráctil diferenciado o bien desdiferenciarse hacia un fenotipo proliferativo, lo que podría venir determinado por el equilibrio entre las vías AKT y ERK. En nuestros estudios hemos encontrado un aumento de la activación de ERK1/2 y una disminución de la fosforilación de AKT en aortas de ratas hipertensas. Nuestros resultados muestran que el tratamiento con GW0742 aumenta la fosforilación de AKT en aortas de SHR. En el presente estudio, el aumento de la fosforilación de ERK1/2 encontrado en SHR se redujo significativamente tras el tratamiento con GW072. El cambio en el equilibrio entre las vías AKT/ERK inducido por este agente, puede participar en la regulación del cambio fenotípico de las células del músculo liso vascular en SHR, conduciendo a una disminución del remodelado vascular. En teoría, estos efectos antiproliferativos pueden contribuir a los efectos antihipertensivos de GW0742 y explicar sus efectos en el remodelado de las arterias de resistencia. Se observaron núcleos positivos en rojo en la adventicia, media y las células endoteliales de las secciones de aorta que se incubaron con DHE. La fluorescencia nuclear roja del etidio se cuantificó y fue normalizada con la fluorescencia azul del marcador nuclear DAPI, lo que permite comparaciones entre diferentes secciones. Los anillos de SHR mostraron un marcado aumento en la tinción de la adventicia, media y las células endoteliales, en comparación con las ratas WKY y se redujo significativamente por GW0742, sólo en SHR. El aumento de la producción de aniones superóxido a través de la vía de NADPH oxidasa contribuye al desarrollo de la hipertensión y la disfunción endotelial en ratas SHR y en la hipertensión esencial. El tratamiento crónico con GW0742 disminuyó el estrés oxidativo sistémico y vascular en SHR, redujo la actividad NADPH oxidasa tanto la basal como la estimulada por Ang II y disminuyó la expresión de las subunidades de la NADPH oxidasa, p22phox y p47phox. Como la expresión de p22phox y p47phox está regulada por ERK1/2 en células del músculo liso vascular, es probable que la inhibición de la vía ERK inducida por GW0742 esté involucrada en la disminución de estas subunidades de NADPH oxidasa. En la aorta de rata, la vasodilatación dependiente del endotelio está mediada casi exclusivamente por la liberación endotelial de NO. GW0742 mejoró la respuesta vasodilatadora dependiente de endotelio a ACh en SHR, sin verse afectada la respuesta de NPS. Estos datos sugieren que GW0742 mejora la función endotelial en SHR mediante el aumento de la biodisponiblidad del NO, sin cambios en la sensibilidad de la vía NO-cGMP. Varios mecanismos podrían estar involucrados en este efecto, incluyendo un aumento en la expresión de eNOS, una disminución de su regulador alostérico negativo, caveolina-1, y una reducción de los niveles de O2.- vascular y, por tanto, la reducción de la inactivación de NO por O2.-. Además, el aumento de la vasoconstricción inducida por Ang II en SHR se redujo significativamente por la activación PPARß, posiblemente por la restauración de la expresión de RGS. La inflamación vascular juega un papel crucial en la progresión del daño vascular asociado a la hipertensión y es el enlace entre la presión arterial elevada y la aterosclerosis. Se sabe que la activación de ERK1/2 incrementa la expresión de una variedad de genes proinflamatorios y proaterogénicos, incluyendo TNF¿, IL-1ß, IL-6 e ICAM-1. De hecho, el aumento de la actividad de ERK1/2 en aorta de SHR, se acompañó de un incremento en la expresión de estos genes, el cual se vio reducido en aorta de SHR tratadas con GW0742. Por lo tanto, estos resultados demuestran que el agonista PPARß efectivamente inhibe la inflamación vascular y la expresión de genes proaterogénicos en aorta de SHR. Los efectos antiinflamatorios de PPARß podrían estar relacionados con la disminución de la presión arterial. Las proteínas RGS desempeñan un papel importante en la regulación de la señalización de los receptores acoplados a proteínas G mediante la unión a la subunidad G activa y la estimulación de la hidrólisis de GTP, finalizando la señalización de la proteína G. Por lo tanto, la disminución de RGS potencia el efecto de vasoconstrictores como ET y Ang II, conduciendo a la activación de ERK1/2. En nuestro estudio, la expresión génica de RGS4 y RGS5 estaba disminuida en SHR en comparación con WKY. Las regiones promotoras de RGS4 y RGS5 contienen PPRE, lo que sugiere que las RGS son dianas transcripcionales directas de PPAR. Del mismo modo, encontramos que la activación de PPARß incrementó la expresión de RGS4 y RGS5 en aorta de SHR, por lo que estaría involucrada en la reducción de la fosforilación de ERK1/2 en ratas SHR tratadas con GW0742. Todos estos resultados sugieren que el aumento de RGS puede ser esencial en los efectos de los agonistas PPARß aquí descritos, incluyendo sus propiedades antioxidantes, antihipertensivas y antiinflamatorias. Para apoyar aun más esta hipótesis, se realizó otra serie de experimentos in vitro, que tuvo como objetivo analizar el papel de PPARß y RGSS en la activación vascular mediada por vías dependientes e independientes de la proteína G. La incubación durante 6 horas con GW0742 reguló al alza RGS4 y RGS5, y estos efectos fueron suprimidos en presencia de un antagonista selectivo de PPARß. Por otra parte, el aumento en la regulación de RGS se asoció con una disminución significativa de la contracción de Ang II y de la actividad NADPH oxidasa estimulada por Ang II y con una inhibición parcial de las respuestas a ET-1 sin inducirse alteraciones en las respuestas a Phe, agonista ¿-adrenérgico, y KCl, vasoconstrictor independiente de receptor. Esta disminución de los efectos de Ang II y ET-1 no se asoció con cambios en la expresión del receptor tipo 1 de Ang II o del receptor ETA. En conclusión, nuestros resultados demuestran claramente que la activación de PPARß reduce la presión arterial elevada, el remodelado vascular, la disfunción endotelial y el estrés oxidativo vascular en este modelo de hipertensión genética. Estos efectos parecen ser consecuencia del aumento de la biodisponibilidad del NO, debido a la reducción de la producción de O2.- mediada por NADPH oxidasa. Los efectos protectores en la pared vascular están relacionados con la regulación al alza de las vías de eNOS y AKT y con una reducción de la actividad ERK1/2 a través de la disminución de la expresión de caveolina-1 y el incremento de la expresión de RGS4 y RGS5. Los niveles arteriales de O2.- se encuentran elevados en los modelos de hipertensión dependientes de renina, lo que se atribuye en gran medida a la activación de la NADPH oxidasa mediada por Ang II. Sin embargo, un exceso de la producción de O2.- vascular también se ha encontrado en el modelo de hipertensión arterial DOCA-sal, donde la actividad de la renina plasmática está disminuida debido a la retención de sodio. Los pacientes con bajos niveles de renina (por ejemplo, en la hipertensión sensible a sal) representan aproximadamente el 30% de los hipertensos esenciales y muestran una mala respuesta terapéutica a los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) y los bloqueantes de los receptores de la angiotensina. Se ha demostrado que la ET-1 contribuye a la patogénesis de la hipertensión sensible a sal, secundaria a un estado bajo de renina, tanto en animales como en humanos. ET-1 es el vasoconstrictor más potente producido en la pared vascular y también aumenta la producción vascular de O2.-, al menos en parte, a través de la vía ETA/NADPH oxidasa que conducen a disfunción endotelial y a hipertensión arterial. Por lo tanto, el tercer objetivo propuesto en esta Tesis Doctoral es: evaluar si el tratamiento crónico con GW0742 previene el desarrollo de hipertensión y disfunción endotelial en el modelo DOCA-sal y, determinar los mecanismos subyacentes, centrándonos sobre todo en la participación de ET-1 y de estrés oxidativo. Como ya hemos demostrado, la dosis de 5 mg/Kg de GW0742 ejerce efectos antihipertensivos, restaura la estructura y función vascular y reduce el estado oxidativo, proinflamatorio y proaterogénico en SHR. Estos efectos protectores parecían estar relacionados con una mayor expresión de RGS4 y RGS5, que modula negativamente las acciones vasculares de la Ang II. Nuestros datos en el modelo DOCA-sal muestran que esta dosis de GW0742 sólo origina efectos antihipertensivos, sin afectar a la función endotelial ni al estrés oxidativo, lo que concuerda con la menor eficacia de los fármacos que reducen la actividad del sistema renina-angiotensina en los modelos de hipertensión independientes de la renina, como la hipertensión DOCA-sal, por ejemplo, los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y antagonistas de los receptores AT-1. Las ratas que recibieron DOCA-sal mostraron un aumento progresivo de la PAS, en comparación con los animales del grupo control. Este aumento fue significativo a partir de la primera semana, alcanzando una diferencia de aproximadamente 44 mmHg al final del tratamiento. El tratamiento crónico con 5 y 20 mg/Kg de GW0742 previene, de una manera dosis-dependiente, el aumento de la PAS (alrededor del 61 y el 100%, respectivamente) en ratas DOCA-sal tratadas a partir de la segunda semana, sin provocar efecto en los animales control. Al final del experimento se redujo la frecuencia cardíaca en el grupo DOCA-sal, en comparación con el grupo control, y no fue modificada por las dos dosis de GW0742. GW0742 fue incapaz de reducir el mRNA de la preproET-1 vascular y los niveles plasmáticos de ET-1, mostrando una diana diferente a la de PPAR¿ y PPAR¿ para mejorar la función cardiovascular en ratas DOCA-sal. Paradójicamente, la dosis de GW0742 20 mg/Kg aumentó la expresión génica de la preproET-1 en ratas DOCA-sal. El mecanismo de esta respuesta aún no se ha establecido, pero esta respuesta fue similar a la que se encontró con el antagonista no selectivo de ET, bosentan, lo que sugiere que el bloqueo de la señalización de ET-1 da lugar a un aumento del mRNA de la preproET-1 en el tejido vascular, y que la dosis más alta de GW0742 también puede interferir con la señalización intracelular de ET-1. La rata DOCA-sal es un modelo de hipertensión grave y se caracteriza por un aumento del contenido de ET-1 en el tejido y de fibrosis e hipertrofia cardíaca. En el presente estudio, GW0742, a pesar de su efecto antihipertensivo, redujo la hipertrofia cardíaca sólo con la dosis más alta, pero fue incapaz de reducir los niveles plasmáticos de ET-1, lo que sugiere que el efecto protector podría estar relacionado con la interferencia con señales de ET-1 en el miocardio que conducen a la hipertrofia cardíaca. La expresión de PPARß en la aorta se incrementó en ratas DOCA-sal y en SHR en comparación con las ratas control. El tratamiento crónico con GW0742 revirtió estos cambios. Sin embargo, a pesar del aumento de PPARß en la aorta de las ratas DOCA-sal, la expresión génica de su gen diana, PDK4 se mantuvo sin cambios. Este cambio en la expresión de PPARß podría estar relacionado con una escasa captación de ligandos endógenos PPARß, como ya se sugirió en las ratas SHR que son genéticamente deficientes en CD36. Sin embargo, no hay información acerca de la expresión de CD36 en la aorta de ratas DOCA-sal. Es interesante que GW0742 indujo, de una manera concentración-dependiente, un incremento en la expresión del gen PDK4 en la aorta, lo que confirma que el tratamiento crónico con GW0742 activó PPARß en el sistema vascular. En el presente estudio también se mostró una disociación clara entre la elevada presión arterial y la función endotelial, ya que GW0742 a 5 mg/Kg fue incapaz de mejorar la disfunción endotelial, pero evitó el aumento de la PAS (alrededor del 61%), indicando la participación de otros mecanismos antihipertensivos independientes de la función endotelial. La disminución de la vasodilatación aórtica dependiente de endotelio es una característica de la hipertensión DOCA-sal. Esta disfunción endotelial no estaba relacionada con cambios en la vía guanilato ciclasa-cGMP o con cambios en la expresión de eNOS, ya que las respuestas al donador de NO, NPS, y del contenido proteico de eNOS no se modificaron. De acuerdo con los resultados anteriores en este modelo, la disfunción endotelial se asoció con un aumento del O2.- vascular. La ET-1 está implicada en el desarrollo del estrés oxidativo y la disfunción endotelial en ratas DOCA-sal, ya que el bloqueo de los receptores ETA reduce los niveles de O2.- arterial y mejora la relajación dependiente del endotelio. En nuestro estudio encontramos que en las ratas DOCA-sal aumentaron los niveles plasmáticos de MDA, un indicador de la producción de ROS sistémica, y ET-1, también aumentó la excreción urinaria de isoprostanos y el contenido de O2.- en la aorta en relación con las ratas control, lo que se asocia con una disminución de la respuesta vasodilatadora dependiente del endotelio inducida por ACh. Se observaron núcleos positivos en rojo en la adventicia, media y las células endoteliales de las secciones de aorta que se incubaron con DHE. La fluorescencia nuclear roja del etidio se cuantificó y fue normalizada con la fluorescencia azul del marcador nuclear DAPI, lo que permite comparaciones entre diferentes secciones. Los anillos de DOCA-sal mostraron un marcado aumento en la tinción de la adventicia, media y las células endoteliales, en comparación con las ratas WKY y se redujo significativamente por GW0742, sólo en DOCA-sal tratadas con 20 mg/Kg. Se conoce que la ET-1 activa la NADPH oxidasa vascular para producir O2.- en ratas DOCA-sal a través de la regulación al alza de las subunidades de la NADPH oxidasa: NOX-4, p22phox y p47phox se incrementaron en la aorta de las ratas DOCA-sal y que este aumento está asociado con mayores niveles en la producción vascular de O2.-. Además, 20 mg/Kg de GW0742 redujeron el aumento del contenido intracelular de O2.-, la actividad NADPH oxidasa, la expresión de NOX-4 y la alteración de la relajación inducida por la ACh, sin provocar efectos en los niveles plasmáticos de ET-1 ni en la expresión génica de preproET-1 en la aorta. En conjunto, todos estos datos indican que la mejoría de la disfunción endotelial inducida por GW0742 parece estar relacionada con un aumento de la biodisponibilidad del NO al reducir la producción de O2.- por NADPH oxidasa, estimulada por la ET-1 en anillos de aorta. Otros mecanismos podrían contribuir a esta mejora tales como un posible aumento de la síntesis de NO, como resultado de una disminución del regulador alostérico negativo de la eNOS, caveolina-1, y una mayor sensibilidad a la vía NO-GMPc, como lo demuestra el pequeño aumento en la relajación a NPS inducida por GW0742 en ratas DOCA-sal. Además, cuando los anillos aórticos se incubaron in vitro con ET-1 para inducir la disfunción endotelial, GW0742 restauró la alteración de la relajación a la ACh, lo que demuestra una interferencia con la señalización de la ET-1 que conduce a la disfunción endotelial. Este efecto protector fue suprimido por el antagonista PPARß, GSK0660, apoyando la participación de PPARß en los efectos de GW0742. La expresión génica de RGS5 disminuyó en ratas DOCA-sal, en comparación con las ratas control. Asimismo se encontró que GW0742 a la dosis de 20 mg/Kg restauró la expresión de RGS5 en la aorta de ratas DOCA-sal a niveles similares a los encontrados en las ratas control, sin provocar cambios en la expresión del receptor ETA, por lo que podría originar en la reducción de la señalización de ET-1 por GW0742 en las ratas DOCA-sal. Todos estos datos sugieren que el aumento en la expresión de RGS5 puede ser un paso esencial en los efectos de los agonistas PPARß descritos en esta Tesis Doctoral, incluyendo sus efectos antioxidantes, antihipertensivos y el efecto protector sobre la función endotelial. Sin embargo, la dosis de 5 mg/Kg GW0742 fue incapaz de aumentar la expresión de RGS5 en ratas DOCA-sal, lo que indica la participación de otros mecanismos independientes de la síntesis y/o la señalización de ET-1. También se encontró que GW0742 indujo una respuesta relajante dependiente de la concentración en las pequeñas arterias mesentéricas, que fue significativa a concentraciones < 1microM y podría colaborar a reducir la PAS. Esta respuesta vasodilatadora parece ser independiente de la liberación de NO endotelial, ya que no se modificó por la inhibición de la eNOS con L-NAME, y de la activación PPARß, ya que no se vio afectada por el antagonista PPARß, GSK0660. En conclusión, nuestros resultados demostraron claramente que la estimulación de PPARß por GW0742 a las dosis de 5 y 20 mg/Kg previene el aumento de la presión arterial, y con la dosis más alta se mejora la hipertrofia cardíaca, la disfunción endotelial y el estrés oxidativo vascular en el modelo de hipertensión inducida por mineralocorticoides. La mejora de la función endotelial podría deberse al aumento de la biodisponibilidad del NO, derivada de la reducción de la producción de O2.- estimulada por la ET-1. El aumento en la expresión de RGS5, que inhibe la señalización de ET-1, podría ser responsable de los efectos protectores en la pared vascular. La vía de señalización intracelular responsable de las acciones vasculares de la Ang II es más sensible a la inhibición por GW0742 que la de ET-1.