Estudio epidemiológico y molecular de parásitos intestinales en niños marroquíes

Resumen

En este trabajo nos propusimos conocer el estado actual de las parasitosis intestinales en la población infantil de Tetuán mediante un estudio epidemiológico conducente al tratamiento de los niños afectados por enteroparásito y la caracterización molecular de Giardia, el principal enteeropatógeno de los niños estudiados. Introduccíon los parásitos intestinales constituyen un serio problema de salud pública que afecta a la población mundial, influyendo en el estado nutricional e intelectual de las personas. Muchos factores están asociados a las parasitosis intestinales y favorecen su aparición y diseminación. Entre ellos: Factores ambientales¿ son la temperatura cálida, la humedad relativa, y la pluviometría de zonas tropicales. Factores socioculturales y económicos¿ como la escasa educación en las prácticas higiénica que tiene la población y las malas condiciones sanitarias que implican la defecación al aire libre por ausencia de letrinas y redes de distribución y tratamiento del agua. Factores dependientes del huesped: como el estado inmunológico de las personas, que hace que los parásitos se multipliquen más activamente en pacientes inmunodeprimidos. -Programas de control frente a los enteroparásitos En mayo de 2002, la Asamblea General de las Naciones Unidas sobre la Infancia emitió el documento titulado ¿Un mundo apropiado para los niños¿, en el que los líderes mundiales acordaron ¿reducir la prevalencia de las parasitosis intestinales¿ y reconocieron la estrategia de desparasitación masiva como una herramienta útil a este propósito. Hay que considerar que según la OMS, 2012 aproximadamente 1.5 millones de niños mueren al año de diarrea, muchos de ellos por parásitos intestinales, y el 90% de estos casos se debe a agua contaminada o falta de higiene. Datos de los últimos años reflejan más del 80% de prevalencia en niños en países en vías de desarrollo, frecuencia de multiparasitismo del 20% y una de las más importantes causas de mortalidad. Además más de 270 millones de niños en edad preescolar y más de 600 millones en edad escolar viven en zonas con intensa transmisión de geohelmintos y necesitan tratamiento e intervenciones preventivas. Las parasitosis tienen mayor importancia en los niños en edad preescolar y escolares hasta 7 años, quienes son más susceptibles que otros grupos de edad a ellas y pueden causarles una profunda repercusión sobre su crecimiento y desarrollo. -Algunos datos de los trabajos previos más relevantes realizados en Marruecos . resaltan la importancia del riego de verduras y hortalizas con residuales que implicó que casi el doble de niños estuvieran parasitados con respecto a las zonas donde esto no se realiza. Y también, que en la mayor parte de los trabajos predominan los protozoos y entre ellos Giardia. En nuestro trabajo epidemiológico Giardia fue el enteroparásito patógeno más frecuente. Por ello decidimos realizar un estudio de caracterización molecular de Giardia. Esta tabla muestra las especies y ensamblajes de Giardia. Actualmente se aceptan 7 especies de Giardia: G. agilis, G. ardeae, G. microti, G. muris, G. psittaci, G. varani y G. duodenalis (G. intestinalis, G. lamblia). -Este parasito se considera como una especie compleja dividida en 8 grupos genotipos o ensamblajes, A-H. -Los subemsablajes AI y AII asi como los BIII y BIV son habituales en personas , y los demás se ecuentran en animales . Material y Métodos Hemos realizado un estudio epidemiológico de enteroparásitos en escolares de la provincia de Tetuán (Marruecos), tanto en zonas rurales como urbanas. Tetuán es una ciudad del norte de Marruecos, está ubicada en las proximidades del mar Mediterráneo, limita al sur por la provincia de Larache, al este por la provincia de Chefchauen y al oeste por la Wilaya de Tanger. Su clima es mediterráneo y está atravesado por muchos ríos, entre los principales el Martil y el Ouedlaou. Zonas urbanas: Boujarah, El Barrios, Ajbal Darsa, Jamaa El Mazouak, Kuelma. Estos barrios tienen un nivel de vida medio-bajo y no todas las casas disponen de agua potable o servicios, conviviendo frecuentemente con animales de compañía. Zonas rurales: Mellalyéne, Ben Karrich, Azla , Souk el Kadim . Estos barrios están formados por casas construidas por sus propietarios con cemento, adobe o ladrillo. La mayoría de las viviendas carecen de agua potable, por lo que se abastecen de agua de pozos. El hacinamiento es frecuente y abundan los animales domésticos. Las fases hemos realizados han sido las siguientes: Visitas a los colegios, fichas identificativas, estudio de peso y talla de los niños, diagnóstico coprológico, estudio nutricional y entrega de resultados y tratamiento de los niños parasitados. para realizar el análisis coprológico se hizo primero un examen macroscópico de las heces para poder observar la presencia de grasa, sangre o incluso parásitos o los parasitos . Después se realizó el examen microscópico directo y se ensayaron diferentes las siguientes técnicas de concentración y tinciones: concentración por sedimentación, concentración por flotación utilizamos (métodos de Fulleborn y Willis), concentración por sedimentación-flotación utilizamos (métodos de Faust, Ritchie y Telemann) y las tinciones de Giemsa y Ziehl-Neelsen. Las dos técnicas de Rechit y Faust fueron las mejores por eso hemos realizados ambas técnicas y como se compararon cuantitativamente. Previamente a la realización de cualquier técnica de concentración hay que seguir el siguiente protocolo de lavado de las muestras: -Se Homogeniza la muestra con agua, se filtra a través de gasa y se lava varias veces con agua mediante centrifugación a 3.000 r.p.m durante 10 min. También hemos realizado un estudio nutricional de los niños mediante antropometría. En nuestro estudio se han utilizado las tablas para cada sexo en percentiles del Indice de Masa Corporal (IMC), CDC. Se calculó el IMC de cada niño y dentro de cada grupo de edad y se clasificaron a todos los niños en tres categorías según su estado nutricional: desnutrición, normal o sobrepeso. Análisis molecular de las especies, genotipos y ensamblajes de Giardia presentes en las muestras fecales. Este es el primer estudio molecular hecho en Marruecos. La metodología que empleamos fue la siguiente: -Para la ruptura/digestión de los quistes se emplearon varias técnicas como son: Choque térmico, los quistes fueron sometidos con 10 ciclos de congelacio descongelación con cambio de Temperatura -80cy 80 durante 30 minutos. -Acción enzimática y choque térmico. -La sonicación en tampón de lisis ha sido la más efectiva Para la extracción del ADN genómico de Giardia hemos utilizado mini kit QIAamp que corresponde a un método de extracción por columna de intercambio iónico que permite la purificación de ADN de muestras frescas o congeladas que presentan gran concentración de inhibidores de PCR. La técnica se resume de la siguiente forma: (leer toda la técnica del esquema). -la mayoría de las muestras el nº de quistes de Giardia era pequeño, la concentración obtenida de ADN fue escasa por esto hemos purificado el ADN mediante un kit de purificación de ADN. La técnica empleada es la siguiente (leer el esquema). -La cuantificación de ADN midiendo la absorbancia a 260-280 nm. Las tecnicas que hemos realizados son las siguientes: Ensayo de PCR 1 Ensayo de PCR 2 Ambas permiten amplificar ensamblajes y subensamblajes de Giardia . -Los productos obtenidos de las PCR 1 y 2 se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y las bandas obtenidas se tiñeron con bromuro de etidio. -la purificación de los productos obtenidos por PCR empleando el kit Wizard® SV que se realiza de la siguiente forma: explicarlo -la secuenciación de los productos de PCR, y las secuencias obtenidas se compararon efectuando un alineamiento local mediante la introducción de la secuencia parcial en el programa bioinformático del Centro Nacional de Información para Biotecnología (NCBI) empleando Blast para nucleótidos. conclusiones 1.Los parásitos intestinales constituyen actualmente un problema de salud pública en la población infantil de Tetuán. La prevalencia de enteroparásitos encontrada en este estudio ha sido de 62.5%. 2.La técnica de Ritchie es más efectiva que la técnica de Faust, recuperándose el doble de parásitos de las muestras fecales. 3.Los IPS fueron similares en zonas urbanas y rurales, pero los IPC fueron superiores en zonas rurales. En el caso de enteropatógenos ambos IPS e IPC son superiores en zonas rurales. 4.No se observaron diferencias en la distribución de enteroparásitos por sexo, pero si por edad, siendo los niños de 8-14 años los más parasitados y entre ellos los de 8-10 años los más parasitados por enteropatógenos. En cuanto a la variación estacional, se aprecia un claro descenso de parásitos en invierno. 5.El multiparasitismo no es muy frecuente en la población infantil de Tetuán y solo 14% de las muestras contenían 2,3,4 o 5 parásitos. 6.Blastocystis hominis fue el enteroparásito más frecuente con diferencia (61.6%). La prevalencia de protozoos fue muy superior a la de helmintos (33.9% frente a 4.5%). Los protozoos enteroparásitos con mayor prevalencia fueron Giardia duodenalis (18.5%) y Cyclospora cayetanensis (8.3%). 7.La desnutrición afectó a 28.1% de los niños y fue similar en niños de zonas urbanas y rurales, pudiendo apreciarse una posible asociación con patógenos como G. duodenalis y C. cayetanensis. 8.Hemos realizado el primer estudio de caracterización molecular de Giardia en Marruecos. 9.Para el estudio de genotipos y subgenotipos de Giardia recomendamos, por su mayor sensibilidad, la técnica de Read y cols. 2004 que amplifica un fragmento de 432 bp del gen de la glutamato deshidrogenasa (gdh). 10.En la población infantil estudiada en Tetuán predomina el ensamblaje B (81.7%) frente al A (18.1%). Suponemos, por tanto, que la transmisión ha sido antroponótica y subrayamos la importancia de los portadores asintomáticos en la transmisión de G. duodenalis, ya que muy pocos niños presentaron síntomas. 11.Todos los niños afectados por enteroparásitos patógenos han sido tratados siguiendo la posología indicada por los médicos de los correspondientes centros de salud.