Molecular mechanisms of growth and development inhibition in fungi and plants by chitosan

Resumen

Los hongos filamentosos y las levaduras son microorganismos eucariotas con modos de vida diversos. Éstos aparecen como microorganismos unicelulares o multicelulares. Hay descritas más de 70,000 especies de hongos, aunque se estima que existe más de un millón y medio de especies (Hawksworth, 1991; Hawksworth et al., 1995). Los hongos forman un grupo filogenético diferente al de los animales o plantas, el cual se incluye en organismos con una amplia variabilidad en modos de vida. Se incluyen microorganismos tales como hongos filamentosos y levaduras, sin embargo también existen especies que presentan estructuras macroscópicas (vulgarmente conocidos como “setas”). Así pues, se reconocen 5 grandes grupos taxonómicos en el reino de los hongos: Ascomycota, Basidiomycota, Glomeromycota, Zygomycota y Chytridiomycota (Lutzoni et al., 2004). El grupo taxonómico de los Ascomycota o Ascomicetos es el que presenta un mayor número de especies. Este grupo incluye hongos filamentosos y levaduras, además de algunas especies dimórficas que presentan ambos niveles de organización celular, dependiendo de las condiciones ambientales o del estadío en su ciclo biológico. Estos microorganismos se caracterizan generalmente por presentar un micelio formado por hifas septadas, cuyas paredes contienen quitina y glucanos. Dichas hifas presentan una continuidad citoplasmática debido a la presencia de poros simples en la zona central de los septos que permiten el movimiento de orgánulos y del material citoplasmático a lo largo del micelio. Las levaduras no forman micelio, sólo estructuras unicelulares que se dividen por gemación. Los Ascomycota presentan reproducción sexual en la que se produce la fusión de núcleos de microorganismos con mating-type complementarios. Esta fusión deriva en el desarrollo de una fase meiótica seguida, en muchos de ellos, de una segunda división mitótica que finalmente da lugar a una estructura de 8 núcleos llamada asca. Estas estructuras maduran a través de acumulaciones de citoplasma, dando lugar a estructuras individualizadas conocidas como ascospora, las cuales maduran en el interior del asca. Dentro de este grupo de organismos destacan importantes hongos patógenos humanos (Aspergillus sp., Candida sp. o Fusarium sp.), así como importantes hongos patógenos de plantas (Botrytis spp., Alternaria spp., Magnaporthe spp.). Además, se incluyen organismos modelo utilizados en investigación como Neurospora crassa o Saccharomyces cerevisiae. Dichos organismos también han sido utilizados en aplicaciones biotecnológicas (desarrollo de nuevos compuestos antifúngicos), agricultura (control biológico) o en el desarrollo de productos alimenticios (fermentación de cebada). El segundo gran grupo de hongos son los Basidiomycota o Basidiomicetos. Se trata de un taxón muy diverso con más de 20,000 especies descritas. Se caracterizan por la formación de basidios en los cuales se forman las basidiósporas (generalmente cuatro). El micelio de estos hongos posee hifas septadas con poros complejos (doliporo-parentosoma) que limitan el movimiento de núcleos y otros orgánulos. La fase sexual de estos hongos implica fusión de hifas y la formación de dicarions como en los Ascomycota. Sin embargo, a diferencia de aquellos, la dicariofase de los Basidiomicetos es larga. Muchos de estos organismos forman basidiocarpos o cuerpos fructíferos macroscópicos conocidos vulgarmente como setas. En este grupo de hongos se incluyen especies utilizadas (muchas cultivadas) para el consumo humano en alimentación como Boletus edulis, Agaricus bisporus. o Lactarius deliciosus. Por otro lado, existen otras especies con representantes unicelulares que se han descrito como patógenas para los seres humanos (Cryptoccocus spp.). Los Basidiomicetos y Ascomicetos forman el subreino Dikarya que engloba a los hongos más evolucionados y con mayor biodiversidad. Otros grupos de hongos filogenéticamente independientes son los Glomeromycota, Zygomycota y los Chytridiomycota (James et al., 2006; Maddison and Schulz, 2007; Schoch et al., 2012). Los hongos presentan gran variedad de ciclos biológicos, además de ser capaces de colonizar un amplio rango de nichos ecológicos. Estos organismos presentan una enorme plasticidad ecológica, lo que se refleja en su papel determinante durante el desarrollo de los diferentes ecosistemas terrestres; los hongos filamentosos jugaron un papel determinante en la colonización del medio terrestre por las plantas (Brundrett et al., 2002). Estos organismos cuentan con la capacidad de interaccionar con materia orgánica (saprófitos) o con organismos vivos como patógenos o parásitos (Lowe and Howlett, 2012). Los hongos saprófitos como N. crassa juegan un papel determinante en el reciclado de nutrientes. A su vez, tiene la capacidad de expresar una enorme batería de enzimas extracelulares que permiten la degradación y asimilación de la materia orgánica, que de otro modo se acumularía en los ecosistemas (Crowther et al., 2012). Por otra parte, los hongos patógenos infectan huéspedes de los que obtienen los recursos necesarios para realizar su ciclo biológico. Estos microorganismos pueden infectar a seres humanos y a muchos otros animales, como a nematodos o insectos, así como a plantas (son los responsables de la mayoría de sus enfermedades) e incluso otros hongos. En este grupo de organismos, cabe destacar algunas especies que se han utilizado históricamente para investigación básica. Estos organismos “modelo”, gracias a la facilidad con la que se cultivan, manejan y transforman genéticamente. Así pues, han sido empleados para el desarrollo de nuevos compuestos antimicrobianos o para el desarrollo de nuevos procesos biotecnológicos, entre otros estudios. En la actualidad, con el desarrollo de la biología sintética, estos organismos adquieren un papel primordial en las “cajas de herramientas” (toolboxes) que se utilizan para diseñar nuevas vías y procesos, por ejemplo, en el desarrollo de biocombustibles de nuevas generaciones. Uno de los hongos modelo por excelencia, utilizado en infinidad de estudios de investigación, es Neurospora crassa. Este hongo filamentoso se ha empleado en investigación desde los años cuarenta del siglo pasado en estudios de fisiología, genética, bioquímica o biología molecular (Lindergben and Rumann, 1938; McClintock, 1945; Beadle and Tatum, 1945; Westergaard and Mitchell, 1947). Esta especie de hongo presenta un ciclo biológico completo en el laboratorio con fases de reproducción sexual y asexual (Davis and Perkins, 2002). La reproducción sexual o fase teleomórfica de N. crassa permite la diferenciación de protoperitecios (cuerpo fructífero inmaduro). Esta estructura sexual se desarrolla tras la fusión de núcleos procedentes de hifas con mating-type complementarios. Durante este proceso se suceden, como ya se ha indicado, una meiosis completa y una mitosis. Finalmente, estos procesos regulados genéticamente dan lugar a la diferenciación del ascoma o estructura reproductora madura (peritecio) con las ascas que a su vez contienen las ascosporas. La reproducción asexual o fase anamórfica tiene lugar cuando las ascosporas haploides germinan y generan el micelio del hongo. En dicho micelio se diferencian los conidióforos o estructuras reproductoras asexuales. Los conidioforos producen mitósporas (macro- o microconidios). Finalmente estas unidades reproductoras o propágulos se diseminan mediante acción del viento. Con la secuenciación del genoma de N. crassa (Galagan et al., 2003) y las nuevas técnicas de secuenciación masiva, se ha generado la colección de mutantes de pérdida de función para genes no esenciales del hongo (Colot et al., 2006; Dunlap et al., 2007). Estas herramientas, junto con el desarrollo de técnicas de análisis transcriptómico masivo, (RNAseq) han permitido la realización de estudios de genómica funcional. Estos recursos se han utilizado en esta Tesis doctoral para investigar el modo de acción del quitosano, un compuesto antifúngico de origen natural. La investigación básica en organismos modelo como N. crassa permite abordar estudios de organismos no modelos causantes, por ejemplo, de importantes infecciones en seres humanos. Los hongos patógenos de seres humanos se consideran el agente causal de importantes enfermedades infecciosas (Brown et al., 2012). Estos organismos se clasifican como patógenos primarios o patógenos oportunistas en función del grado de especialización necesario para causar las infecciones en tejidos humanos (mamíferos). Los patógenos primarios invaden y colonizan los tejidos del huésped evadiendo sus defensas. Por el contrario, los organismos oportunistas causan infecciones en huéspedes aprovechando deficiencias en el sistema inmune de los mismos. Dichas deficiencias se deben a la utilización de terapias que inhiben el sistema inmune (pacientes trasplantados o enfermos tratados con quimioterapia) o por enfermedades como el SIDA (Bodey et al., 1989; Dening 1998). Dichas infecciones resultan difíciles de controlar y en muchas ocasiones suelen resultar fatales. Además de estas graves enfermedades fúngicas, se produce una elevadísima incidencia de infecciones menores causadas por hongos. Es el caso de infecciones fúngicas en el tracto vaginal y mucosas de mujeres, principalmente, así como infecciones cutáneas o en las cavidades oculares. Estas infecciones no suelen revestir una gran gravedad ya no comprometen la vida del huésped, y se suelen controlar mediante la aplicación de antifúngicos de uso convencional como azoles, polienos o equinocandinas. En esta Tesis se ha investigado el potencial del quitosano en el control de infecciones por hongos patógenos oportunistas humanos (hongos filamentosos y levaduras). Así mismo, se ha evaluado la capacidad antifúngica del quitosano in vitro e in vivo en huéspedes invertebrados modelo Galleria mellonella. Los hongos filamentosos utilizados en esta Tesis doctoral han sido Fusarium proliferatum (Matsush.) Nirenberg, Aspergillus fumigatus (Fresenius), Hamigera avellanea (Thom and Turesson) Stolk and Samson, Rhizopus stolonifera (Ehrenb) Vuill. El género de hongos filamentosos Fusarium sp. es causante de importantes micosis principalmente mediante la colonización de tejidos blandos. Al tratarse de un microorganismo patógeno oportunista, las infecciones causadas se suelen dar en pacientes inmunosuprimidos que muestran una elevada tasa de mortalidad (Alastruey-Izquierdo et al., 2008). En esta Tesis, se ha probado la efectividad del quitosano sobre un aislado de F. proliferatum obtenido de la retina infectada de un paciente operado de cataratas (Ferrer et al., 2005). Cabe destacar la gran relevancia de este estudio, puesto que dicho grupo de microorganismos es resistente a la mayoría de antifúngicos convencionales. Las infecciones causadas por Aspergillus fumigatus son la causa principal de infecciones pulmonares en humanos. Este hongo filamentoso es un saprófito oportunista con un metabolismo versátil capaz de desarrollar su ciclo de vida en condiciones ambientales muy diversas (Gibbons et al., 2012). Las infecciones de este microorganismo en pacientes con deficiencias inmunológicas resultan mortales en numerosas ocasiones. Es necesario desarrollar nuevas estrategias para el control de infecciones por A. fumigatus, puesto que las mismas conllevan un elevado coste personal y económico. H. avellanea es un patógeno humano poco usual que se encuentra principalmente en el suelo, sin embargo se han descrito casos clínicos en los que se ha aislado de tejidos humanos (Houbraken et al. 2010). El aislado utilizado en este estudio fue obtenido a partir de una infección sanguínea (hemocultivo) de un neonato en el Hospital General de Alicante. R. stolonifera es un zigomiceto causante de infecciones en mucosas y tejidos blandos en pacientes inmunocomprometidos (Ribes et al., 2000). Las infecciones sistémicas y del tracto respiratorio causadas por este microorganismo suelen resultar fatales. El aislado utilizado en esta Tesis doctoral se obtuvo a partir de una muestra de la fosa nasal periocular infectada de un paciente. En esta Tesis doctoral se ha estudiado la efectividad del quitosano sobre levaduras patógenas de humanos. En nuestra investigación se han incluido especies de los géneros Candida y Cryptococcus. Ambos grupos de levaduras son los causantes del mayor número de infecciones fúngicas diagnosticadas en humanos. En el género Candida cabe destacar la especie Candida albicans por su una elevada incidencia en las infecciones fúngicas. C. albicans se detecta habitualmente colonizando el tracto vaginal, las mucosas y los tejidos blandos. Las infecciones causadas por esta levadura suelen presentar buen pronóstico ya que son sensibles a los antifúngicos utilizados en micología clínica (azoles, equinocandinas o polienos; Moudgal and Sovel, 2010). Las infecciones causadas por esta especie en pacientes con déficit en el sistema inmunitario suelen presentar peores pronósticos debido a las condiciones particulares de dichos pacientes. Las infecciones causadas por otras especies del género Candida requieren tratamientos más especializados debido a la aparición de resistencias a los antifúngicos convencionales. La especie C. glabrata ha aumentado su incidencia en infecciones de pacientes inmunodeprimidos y se considera la segunda especie más importante después de C. albicans (Fidel et al., 1999). Las infecciones causadas por esta especie suelen tratarse con fluconazol u otros derivados de azoles. Se conocen otras especies de este género causantes de sepsis en humanos. Las especies C. kruseii y C. parapsilosis también presentan una elevada incidencia en infecciones causadas por hongos. Su tratamiento requiere de estrategias sinérgicas con varios fármacos antifúngicos para optimizar el control de las infecciones causadas por dichos microorganismos. El otro grupo importante de levaduras causantes de infecciones en humanos son las especies del género Cryptococcus. C. neoformans es la especie con mayor incidencia en humanos. Las modificaciones estructurales de la pared célular y las adaptaciones fisiológicas son esenciales para la patogenicidad de C. neoformans (Del Poeta, 2004; Alspaugh, 2015). El control de infecciones causadas por esta especie se realiza mediante la aplicación de antifúngicos convencionales. C. gattii presenta una menor incidencia en infecciones humanas. La gran variabilidad de patógenos fúngicos y el uso abusivo de los antimicóticos convencionales generan la necesidad de desarrollar nuevas moléculas para el control infecciones causadas por hongos. En esta Tesis doctoral hemos estudiado el modo de acción del quitosano sobre las especies descritas anteriormente, para su desarrollo como una nueva herramienta para el control de enfermedades causadas por estos grupos de microorganismos. Además de la gran variabilidad existente dentro del grupo de organismos patógenos, hay un grupo que destaca de igual modo que los patógenos humanos. Estos son los hongos patógenos de plantas o fitopatógenos. Los hongos son el agente causal de la mayoría de enfermedades vegetales (Talbot, 2003). Las pérdidas de cosechas causadas por estos microorganismos son de gran relevancia en nuestras sociedades. Los brotes epidémicos de hongos fitopatógenos generan enormes pérdidas económicas en cultivos que comprometen la seguridad alimentaria, privando de alimento a grandes núcleos de población. Por otro lado muchos de los fungicidas empleados masivamente resultan altamente tóxicos para organismos no diana y generan resistencias en las poblaciones de los patógenos. Por ello, es necesario estudiar y desarrollar nuevas moléculas para el control de las enfermedades vegetales por hongos. En esta Tesis doctoral hemos estudiado el efecto del quitosano sobre el hongo patógeno causante del quemado del arroz Magnaporthe oryzae. Este hongo causa entorno al 10-30% de pérdidas en las cosechas de arroz a nivel mundial (Skamnioti and Gurr, 2009), lo cual puede resultar devastador debido a que este cultivo constituye una parte de la dieta diaria de gran parte de la población del planeta, especialmente en amplias zonas de Asia (Talbot, 2003). Las infecciones causadas por este hongo se producen en la parte aérea de la planta del arroz. La infección inicia cuando una espora de M. oryzae se sitúa sobre la superficie de la hoja de una planta de arroz. El conidio se adhiere a la epidermis de la planta debido a las condiciones de hidrofobicidad presentes en la misma. La humedad elevada favorece la germinación del conidio y el desarrollo de un tubo germinativo que, tras una serie de modificaciones estructurales y fisiológicas, se diferencia en un apresorio. Esta estructura celular madura mediante la acumulación de presión osmótica que genera presión por turgencia. En este momento se produce la acumulación de melaninas en la pared del apresorio, lo que favorece de manera extraordinaria la acumulación de turgencia (de Jong et al., 1997). Tras una serie de modificaciones celulares y fisiológicas altamente reguladas (Zhang et al., 2011) se produce la diferenciación de una hifa de penetración que permite la invasión y colonización de las células de las hojas de la planta de arroz. La actividad de las NADPH oxidasas genera especies reactivas de oxígeno (ERO) que con la expresión de genes que regulan la organización de citoesqueleto (septinas y actina) poseen un papel esencial en la patogenicidad de M. oryzae (Dagdas et al., 2012; Egan et al., 2006; Ryder et al., 2013; Samalova et al., 2014). En esta Tesis doctoral hemos abordado el efecto antifúngico del quitosano sobre el desarrollo de la infección causada por esta especie en el arroz. Hemos realizado un estudio celular y molecular para conocer la interacción del quitosano sobre los principales genes y estructuras celulares esenciales para la patogenicidad de M. oryzae. Hemos analizado cómo el quitosano afecta a la diferenciación de los apresorios de M. oryzae y a su importancia en la patogenicidad del hongo sobre el arroz. En vista del potencial del uso del quitosano para el control de enfermedades fúngicas vegetales, en esta Tesis doctoral se abordó un estudio para determinar la compatibilidad del uso del quitosano sobre importantes plantas cultivadas. Para ello se realizaron diferentes bioensayos, así como una amplia variedad de análisis fisiológicos, celulares y moleculares que permitieran caracterizar la respuesta de las plantas al quitosano. El quitosano es un polímero natural derivado de la quitina, el segundo polímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa. La quitina es un componente estructural de la cutícula de crustáceos o insectos y de la pared celular de los hongos y de algunas algas (Kaur and Dhillon, 2014). La desacetilación de la quitina para obtener quitosano tiene lugar por procesos enzimáticos o químicos. El grado de desacetilación y el peso molecular del polímero son esenciales para caracterizar su actividad biológica. El quitosano es un policatión soluble en disoluciones ácidas. Por el contrario, los quitoligosacáridos de pequeño peso molecular (< 5000 Da) son solubles en agua. Las características físico-químicas descritas dotan al quitosano de unas propiedades biológicas especiales. El quitosano se ha utilizado en numerosos procesos industriales para el desarrollo de nuevas formulaciones o productos. Como ejemplos, la industria farmacéutica utiliza quitosano en sistemas de liberación de medicamentos, y la industria alimentaria lo emplea para favorecer la absorción de grasas. Además se ha utilizado en otras industrias como cosmética, agricultura o en el diseño de nuevos biomateriales (fibras o nanoencapsulados; Kumar, 2000). El quitosano se describió como compuesto antimicrobiano a finales de los años 1970s (Allan and Hadwinger, 1979). Durante este tiempo se han desarrollado numerosos trabajos de investigación para dilucidar el modo de acción del quitosano sobre hongos (Kong et al., 2010; Park et al., 2008; Raafat et al., 2008). El quitosano inhibe la germinación y provoca cambios morfológicos en las hifas de importantes hongos patógenos post-cosecha como Rhizopus stolonifer y Botrytis cinerea (El Ghaouth et al., 1991). El quitosano inhibe, además, el crecimiento de otros hongos patógenos vegetales como Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Palma-Guerrero et al., 2008). El modo de acción del quitosano se ha basado en la interacción del polímero con la membrana plasmática de los hongos que las desestructura y permeabiliza (Palma-Guerrero et al., 2009). La permeabilización de la membrana fúngica por quitosano depende de la energía celular. El bloqueo de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, así como la disminución del metabolismo celular por descenso de temperatura, evita la acción antifúngica del quitosano (Palma-Guerrero et al., 2009). La actividad inhibidora del crecimiento por quitosano a través de la permeabilización de la membrana plasmática también tiene lugar en organismos procariotas (Je and Kim, 2006). La compatibilidad del quitosano con los hongos nematófagos y entomopatógenos agentes de control biológico permite su uso en estrategias integradas para controlar enfermedades y plagas causadas por nematodos e insectos. El quitosano, además de favorecer la diferenciación de apresorios en el hongo nematófago Pochonia chlamydosporia, induce la expresión de proteasas extracelulares esenciales en la infección de huevos de nematodos (Escudero et al., 2016). Por otro lado, se está estudiando la aplicación en la rizosfera de quitosano en combinación con Pochonia chlamydosporia para el control sostenible de nematodos fitopatógenos. El principal objetivo de esta Tesis doctoral es el estudio del efecto inhibitorio del quitosano sobre el crecimiento y desarrollo de hongos y plantas. Se ha analizado la interacción del quitosano con importantes hongos patógenos de humanos y de plantas, así como sobre el hongo modelo Neurospora crassa. Este estudio trata de desarrollar el quitosano como un antifúngico efectivo para su aplicación clínica y en agricultura. Además se ha investigado la respuesta de plantas a quitosano, con el fin de implementar su uso en sistemas agrícolas. Para este estudio se ha empleado la planta modelo Arabidopsis thaliana, así como importantes cultivos como el tomate y la cebada. La respuesta a quitosano de plantas y hongos se ha estudiado a nivel fisiológico, celular y molecular. Este objetivo general se subdivide en los siguientes objetivos específicos: - Evaluar el efecto de la limitación de nutrientes sobre el modo de acción del quitosano en hongos patógenos de humanos. - Identificar los principales genes diana del quitosano en el hongo modelo N. crassa mediante el uso de recursos transcriptómicos y colecciones de aislados de pérdida de función para genes no esenciales. - Estudiar el efecto del quitosano sobre la diferenciación de apresorios del hongo fitopatóegeno M. oryzae, así como el efecto sobre la organización del citoesqueleto durante el proceso de infección. - Caracterizar la respuesta fisiológica, celular y molecular de las raíces a quitosano, incluyendo los principales genes implicados. A partir de estos objetivos específicos se han desarrollado 4 proyectos de investigación que han quedado definidos en los 4 capítulos de esta Tesis doctoral. Este trabajo de investigación se estructura de la siguiente manera: Chapter 1. Federico Lopez-Moya, Maria F. Colom-Valiente, Pascual Martinez-Peinado, Jesus E. Martinez-Lopez, Eduardo Puelles, Jose M. Sempere-Ortells and Luis V. Lopez-Llorca. 2015. Carbon and nitrogen limitation increase chitosan antifungal activity in Neurospora crassa and fungal human pathogens. Fungal Biology. 119(2-3): 154-69. Chapter 2. Federico Lopez-Moya, David Kowbel, Mª José Nueda, Javier Palma-Guerrero, N. Louise Glass and Luis Vicente Lopez-Llorca. Neurospora crassa transcriptomics reveals oxidative stress and plasma membrane homeostasis biology genes as key targets in response to chitosan. Molecular Biosystems. 12(2): 391-403. Chapter 3. Federico Lopez-Moya, Mark D. Fricker, George Littlejohn, Luis V. Lopez-Llorca and Nicholas J. Talbot. Chitosan arrests Magnaporthe oryzae appressorium differentiation affecting cytoskeletal remodelling. Manuscript in preparation. Chapter 4. Federico Lopez-Moya, Nuria Escudero, Ernesto A. Zavala-Gonzalez, David Esteve-Bruna, Alfonso Prieto, Miguel A. Blázquez, David Alabadí and Luis V. Lopez-Llorca. Chitosan inhibits root growth altering hormone homeostasis and repressing quiescent center WOX5 gene expression. Manuscript in preparation. La versatilidad, aplicaciones y formulaciones del quitosano requiere que su estudio abarque diferentes aspectos. En esta Tesis doctoral, por ejemplo, se ha utilizado un amplio rango de técnicas y análisis para el estudio del efecto del quitosano sobre hongos y plantas. En el Capítulo 1 de esta Tesis se ha investigado el modo de acción del quitosano sobre N. crassa y hongos (filamentosos y levaduras) patógenos de humanos bajo diferentes regímenes nutricionales. La limitación de nutrientes (carbono; C y nitrógeno; N) potencia el efecto antifúngico del quitosano. La disminución en los niveles de nutrientes provoca alteraciones estructurales de la pared celular de hongos que a su vez está directamente relacionada con la integridad de la membrana plasmática (Nitsche et al., 2012; Szilágyi et al., 2013). Se ha demostrado recientemente que la composición (contenido de glucanos) y estructura de la pared celular están directamente relacionadas con la sensibilidad de los hongos a quitosano (Aranda-Martinez et al., 2016). En este capítulo hemos descubierto que existe una conexión directa entre la actividad antifúngica del quitosano y la acumulación de ERO en el interior celular. El quitosano induce estrés oxidativo en el interior celular, lo que se relaciona directamente con la permeabilización de la membrana y con su actividad antifúngica. Se sabe que la permeabilización de la membrana de los hongos por el quitosano depende de la fluidez de la misma (Palma-Guerrero et al., 2010). Los hongos (N. crassa) que presentan un alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados (ácido linolenico) son sensibles a quitosano. Estos ácidos grasos, debido a la presencia de dobles y triples enlaces en su cadena hidrocarbonada, son más susceptibles a oxidación. En este capítulo de la Tesis avanzamos que el estrés oxidativo (ERO) asociado a la presencia de quitosano es la principal causa por la cual se produce la permeabilización de la membrana, y la consiguiente muerte celular. En esta Tesis se ha analizado el uso del quitosano como antifúngico con aplicación clínica. Este polímero mostró actividad fungicida sobre Fusarium proliferatum y Hamigera avellanea, además de actividad fungistática sobre el desarrollo de Aspergillus fumigatus y Rhizophus stolonifer. Hemos determinado que el quitosano es efectivo sobre estos microorganismos en las condiciones de nutrientes (C y N) de la sangre humana. Por otro lado, , el quitosano presenta efectividad como fungicida sobre levaduras de los géneros Candida sp. y Cryptococcus sp., incluyendo especies resistentes (C. kruseii) a los antifúngicos clínicos usados convencionalmente (azoles). La efectividad fungicida del quitosano sobre las diferentes especies de levaduras patógenas en condiciones nutricionales similares a las encontradas en sangre (glucémia), hace del quitosano un compuesto natural con elevado potencial para ser desarrollado como antifúngico. Adicionalmente, en este estudio se ha probado la compatibilidad del quitosano (70 kDa) con cultivos celulares de mamíferos y humanos a concentraciones eficaces sobre hongos patógenos. Además, hemos probado que el quitosano reduce significativamente la virulencia de C. albicans sobre larvas de Galleria mellonella L. Estos resultados abren el camino al desarrollo del quitosano como antifúngico de uso clínico. En el Capítulo 2 hemos abordado el estudio transcriptómico masivo de la respuesta de un hongo filamentoso (N. crassa) a quitosano. Los genes del metabolismo oxidativo y relacionados con la homeostasis de la membrana plasmática son las principales dianas de la respuesta de este hongo a quitosano. Estos resultados transcriptómicos están en consonancia con los resultados del Capítulo 1. Las categorías Gene Ontology (GO), actividad oxidorreductasa, membrana plasmática y transporte son las más significativas en este estudio transcriptómico. Estudios previos realizados con la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae demuestran que el metabolismo oxidativo, la respiración y el transporte juegan un papel determinante en la sensibilidad de este microorganismo a quitosano (Jaime et al., 2012; Zakrzewska et al., 2005). En nuestro estudio transcriptómico se ha abordado un análisis de series temporales que ha permitido identificar la dinámica de expresión de los principales genes implicados en la respuesta a quitosano con el tiempo. Mediante el estudio de mutantes de pérdida de función, se ha confirmado que una Lipasa Clase III, un Transportador de Monosacáridos y una Glutatión Transferasa (NCU03639; NCU04537; NCU10521, respectivamente) son los principales genes diana del quitosano en N. crassa. Estos genes están directamente implicados en procesos de reparación/reorganización de membranas, asimilación de catabolitos y en la amortiguación del efecto de las ERO. En este capítulo, hemos demostrado además que la concentración del calcio (Ca2+), involucrada en los procesos de reorganización de la membrana plasmática y de regulación del metabolismo oxidativo (Fu et al., 2014; Muñoz et al., 2014, Yan et al., 2006), está directamente relacionada con la tolerancia de N. crassa a quitosano. En futuras investigaciones se abordarán estudios moleculares para identificar las bases genéticas relacionadas con la tolerancia de N. crassa a quitosano en presencia de calcio. En el Capítulo 3 se ha abordado un estudio para determinar el efecto del quitosano sobre la diferenciación de apresorios en el hongo fitopatógeno Magnaporthe oryzae. El quitosano retarda el proceso de diferenciación de apresorios además de afectar su estructura y morfología. Dichas alteraciones en el desarrollo de este hongo se traducen en una disminución de su patogenicidad sobre plantas de arroz. El proceso de diferenciación de apresorios está altamente regulado y requiere la organización del citoesqueleto (septinas y actina) en una estructura en forma de anillo esencial para la patogenicidad (Dagdas et al., 2012). El quitosano desacopla el proceso de condensación de las septinas y actina en forma de anillo afectando a su organización. La inhibición causada por el quitosano en el proceso de organización del citoesqueleto impide la formación del poro, estructura necesaria para la patogenicidad, afectando a su vez al desarrollo de la hifa de penetración. La diferenciación del apresorio en M. oryzae requiere de modificaciones de la pared celular y de la membrana plasmática, además de la acumulación de ERO (metabolismo oxidativo). Todos estos procesos están altamente regulados durante la fase de diferenciación del apresorio (Egan et al., 2007; Ryder et al., 2013; Wilson and Talbot, 2009). En este trabajo se ha demostrado que el quitosano permeabiliza la membrana plasmática del apresorio afectando a la organización de las septinas en su interior. Por otro lado se ha probado que el quitosano altera los balances internos de ERO. Estas alteraciones fisiológicas estarían directamente relacionadas con el efecto inhibitorio de la patogenicidad causada por el quitosano sobre M. oryzae. En vista del potencial del quitosano para el control de hongos fitopatógenos, en el Capítulo 4, hemos realizado una investigación para caracterizar la respuesta de plantas (tomate y cebada) a dicho polímero. La aplicación de quitosano en la rizosfera genera alteraciones morfológicas en las raíces dando lugar a una reducción de la longitud radicular y a su engrosamiento. El quitosano altera la polaridad del ápice de las raíces deteniendo la elongación radicular y modificando drásticamente su arquitectura. Mediante la utilización de la planta modelo Arabidopsis thaliana se han estudiado los mecanismos celulares y moleculares implicados en la inhibición generada por el quitosano sobre el desarrollo radicular. De esta manera, se ha probado que el quitosano reprime la expresión de WOX5, un factor de transcripción esencial para la organización y división celular en el centro quiescente de la raíz, estructura que controla la división celular y elongación de la raíz. Se ha encontrado que el quitosano modifica los balances hormonales en la raíz. En concreto, el quitosano genera una acumulación de auxinas (ácido indolacético), así como de hormonas implicadas en la respuesta estrés (ácido jasmónico y ácido salicílico) en la raíz. Estos cambios hormonales serían las principales causas de la reducción en la elongación y desarrollo radicular y por consiguiente del resto de la planta. En futuros estudios, con el fin de identificar dianas específicas en plantas, se evaluará el efecto del quitosano a partir de técnicas de secuenciación masiva. Por tanto, las conclusiones de esta Tesis doctoral son las siguientes: 1. La limitación de carbono y nitrógeno aumenta la actividad antifúngica del quitosano sobre Neurospora crassa e importantes patógenos humanos mediante la permeabilización de la membrana plasmática. 2. El quitosano genera la acumulación de especies reactivas de oxígeno que favorecen la permeabilización de la membrana plasmática de hongos y la consiguiente muerte celular. 3. El quitosano muestra actividad antifúngica sobre importantes patógenos humanos incluyendo especies de Candida resistentes a antifúngicos convencionales. 4. El quitosano resulta inocuo para células humanas y de otros mamíferos, incluyendo células del sistema inmune a concentraciones inhibitorias y letales para hongos patógenos humanos. 5. El quitosano reduce la virulencia de Candida albicans sobre Galleria mellonella L. bajo condiciones nutricionales (carbono y nitrógeno) similares a las de la sangre humana. 6. El quitosano induce la expresión de genes de Neurospora crassa relacionados con la homeostasis de la membrana plasmática, actividad oxidorreductasa y el transporte. 7. Los genes que codifican una Lipasa Clase III, un transportador de monosacáridos y una glutatión transferasa, son las principales dianas del quitosano en Neurospora crassa. 8. El quitosano disminuye la velocidad de diferenciación de apresorios mediante la inhibición de la organización del citoesqueleto (septinas y actina). 9. El quitosano reduce la patogenicidad de Magnaporthe oryzae sobre arroz (CO-39) impidiendo la formación de la hifa de penetración y la infección celular. 10. El riego con quitosano a altas dosis inhibe el crecimiento de plantas mediante la alteración morfológica de las células de la raíz. 11. El quitosano reprime la expresión del factor de transcripción WOX5, necesario para la división celular en el centro quiescente de la raíz, afectando su desarrollo y elongación. 12. El quitosano produce un desequilibrio hormonal en la raíz de Arabidospsis thaliana generando la acumulación de auxinas, ácido jasmónico y ácido salicílico, lo que afecta a la arquitectura radicular.