Effect of RXR/PPAR interaction in angiotensin II-induced vascular inflammation and angiogenesis. Role of CXCL16/CXCR6 axis in angiotensin II or cigarette smoke-induced vascular inflammation

Resumen

Aumentos en los niveles circulantes de mediadores, incluyendo angiotensina II (Ang-II) y citoquinas, han sido detectados en enfermedades cardiovasculares y cardiometabólicas como la hipertensión, la obesidad y la diabetes, y parecen ejercer efectos negativos sobre la función endotelial (Granger et al., 2004; Marinou et al., 2010). Estos agentes inician una cascada inflamatoria de señalización que promueve la generación de especies reactivas del oxígeno, aumento en la superficie celular de la expresión de moléculas de adhesión y mayor adhesividad de leucocitos a las células endoteliales (Libby, 2002; Granger et al., 2004). Estas respuestas están asociadas con la disfunción endotelial, un estado pro-trombótico y pro-inflamatoria del endotelio (Landmesser et al., 2004) que juega un papel importante a las primeras etapas de la aterogénesis (Libby, 2002; Landmesser et al., 2004; Galkina et al., 2009). Rosuvastatina (Rosu) y Bexaroteno (Bex) son fármacos comúnmente prescritos para tratar la hipercolesterolemia y el linfoma de células T, respectivamente, que además han demostrado inhibir la inflamación vascular (Mira et al., 2009; Farol et al., 2004; Sanz et al., 2012) y que, a pesar de su actividad antiinflamatoria, producen graves efectos adversos relacionados con dosis. Aunque generalmente bien toleradas, las estatinas se asocian con miopatías y fallo renal agudo (Golomb et al., 2008; Hoffman et al., 2012; Dormuth et al., 2013). Así mismo, el tratamiento con Bex se asocia con efectos secundarios inevitables y que limitan la dosis administrada, en particular, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia y en menor medida hipotiroidismo (de Vries-van der Weij et al., 2009; Vakeva et al., 2012). Sin embargo, la administración de Rosu reduce los niveles de triglicéridos (Florentin et al., 2013), por ello en las guías clínicas sobre la prescripción segura de Bex se recomienda el uso conjunto con estatinas con el fin de prevenir los efectos dislipémicos (Scarisbrick et al., 2013). Por consiguiente, debido a la necesidad de estrategias más eficaces y seguras para prevenir y tratar la aterosclerosis, en la presente tesis evaluamos el efecto de la coadministración de Rosu y Bex en la inflamación vascular causada por Ang-II. Para ello, células endoteliales de arteria de cordón umbilical humano (HUAEC) fueron tratadas con vehículo, Rosu (10-30 nM), Bexa (0,3-1 ?M) o una combinación de ambos, 20 h antes de la estimulación con Ang-II 1 ?M durante 4h. Sorprendentemente, la combinación de Rosu (10 nM) + Bex (0,3 ?M), que no ejercieron efecto sobre el reclutamiento de células mononucleares inducido por Ang-II cuando ambos fármacos fueron estudiados por separado, significativamente redujo esta respuesta. Este efecto fue acompañado por una disminución de la expresión en el endotelio de ICAM-1, VCAM-1 y CX3CL1 así como de la producción de CXCL1, CXCL8, CCL2 y CCL5 inducida por Ang II. La preincubación de HUAECs con Rosu y Bex inhibió la expresión Nox5 y la consecuente activación de RhoA inducida por Ang-II a través de una mayor expresión RXR?, PPAR? y PPAR?, además del aumento de las interacciones RXR?/PPAR? y RXR?/PPAR?. In vivo, la combinación, pero no la administración por separado, de Rosu (1,25 mg/kg/día) y Bex (10 mg/kg/día), disminuyó significativamente la adhesión de leucocitos a la microcirculación cremastérica arteriolar causada por Ang-II en ratones C57BL/6 y la formación de la lesión aterosclerótica en ratones deficientes en la apolipoproteína E (apoE-/-) sometidos a una dieta aterogénica. Por todo lo anteriormente expuesto podemos concluir que la administración conjunta de Rosu y Bex a dosis subóptimas podría constituir una nueva y eficaz alternativa de tratamiento en el control de la inflamación vascular asociada a desordenes cardiometabólicos debido a que la sinergia en su actividad antiinflamatoria podría contrarrestar sus reacciones adversas. El aneurisma aórtico abdominal (AAA) es una importante causa de muerte en los países desarrollados. A pesar de ello, existe un gran desconocimiento de los mecanismos responsables de la iniciación, propagación y ruptura del AAA. Los estudios realizados demuestran que el sistema renina angiotensina y la angiogénesis juegan un papel fundamental en el desarrollo de esta patología. De hecho, la formación de nuevos microvasos está relacionada con el riesgo de ruptura y las complicaciones que causan la alta tasa de mortalidad asociada a este estado patológico. El Bex es un fármaco agonista del Receptor del Retinoide X (RXR) con actividad antiangiogénica. Dicho receptor forma heterodímeros permisivos con los Receptores Activadores de la Proliferación Peroxisomal (PPAR). A su vez, las estatinas son capaces de activar los receptores PPAR. Dado que nuevos estudios indican que un solo fármaco antiangiogénico puede no ser suficiente para combatir la amplia gama de factores angiogénicos producidos y las vías implicadas en el proceso angiogénico, es importante encontrar nuevos enfoques farmacológicos para detener su la formación y progresión de la lesión. Por lo tanto, en la presente tesis doctoral se investigó el efecto del tratamiento combinado de Rosu y Bex en el AAA inducido por Ang-II así como el proceso angiogénico y los mecanismos subyacentes implicados. Para ello, se administraron durante 28 días ambos fármacos, en un modelo animal de AAA en ratones apoE-/- inducido por Ang-II y dieta grasa. El tratamiento combinado de Rosu y Bex a dosis de 10 mg/kg/día redujo significativamente la incidencia de AAA. Además, dicha terapia combinada disminuyó la neovascularización, la infiltración de macrófagos y los niveles de expresión de ARNm de las quimiocinas KC/CXCL1, MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5 y el factor de crecimiento vascular, VEGF, disminución que parece estar mediada por la activación de las interacciones RXR?/PPAR? y RXR?/PPAR?. Estas respuestas fueron acompañadas de una menor activación de la ruta de señalización AKT/mTOR/p70S6K1. En conjunto, estos resultados sugieren que la combinación a dosis subóptimas de un agonista de RXR y una estatina interfiere sinérgicamente con los mecanismos de señalización que modulan la angiogénesis, así como la inflamación asociada a la misma, pudiendo constituir una nueva herramienta terapéutica para la prevención del desarrollo del AAA. CXCL16 es una quimiocina transmembrana que, debido a su doble función como sustancia quimioatrayente y molécula de adhesión de monocitos y linfocitos, así como su presencia en la pared vascular, hace que sea un candidato atractivo para jugar un papel fundamental en el proceso inflamatorio vascular. Sin embargo, hasta la fecha su papel en AAA y la inflamación vascular inducida por Ang- II no ha sido caracterizado. Por lo tanto, en la presente tesis doctoral se ha investigado la potencial implicación del eje CXCR6/CXCL16 en la inflamación vascular inducida por Ang-II así como los mecanismos relacionados en este proceso. Mediante estudios in vivo, observamos que el tratamiento con Ang-II durante 15 días produjo un aumento en la expresión de CXCL16 en las arteriolas cremastericas del ratón que se correlacionó con un aumento en la adhesión de los leucocitos al endotelio arteriolar. A continuación nos planteamos trasladar estas observaciones a un modelo patológico. Por ello, evaluamos el efecto de un antagonista del receptor AT1 de Ang-II, losartán, y la posible implicación de CXCL16, en un modelo experimental de AAA. Ratones deficientes en apo E -/- fueron sometidos a una dieta rica en grasa y estimulados durante 28 días con Ang-II (500 ng/kg/min). Algunos animales fueron tratados con losartán a dos dosis: 10 y 30 mg/kg/día. Los animales no tratados pero sí estimulados con Ang-II mostraron mayor incidencia de AAA, incremento de la infiltración de macrófagos, linfocitos CD3+, células CXCR6+ y neovascularización. Estos efectos fueron acompañados de un incremento en la lesión de la expresión de ARNm de MCP-1/CCL2, CXCL16, CXCR6 y del factor de crecimiento vascular VEGF. Losartán a una dosis de 30 mg/kg/día, logró reducir todos estos eventos. Mediante estudios in vitro se detectó un aumento en la expresión de CXCL16 cuando las HUAECs fueron estimuladas con Ang-II 1 ?M, la neutralización de su actividad inhibió significativamente la interacción de leucocitos mononucleares a HUAEC inducida por Ang-II. El aumento de la expresión de CXCL16 inducida por Ang-II fue dependiente de la expresión de Nox5, la generación de radicales libres y la subsiguiente activación de RhoA/p38-MAPK/NF?B. Estos resultados sugieren que el eje CXCL16/CXCR6 podría constituir una nueva estrategia terapéutica en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares asociadas a la activación del sistema renina-angiotensina. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad inflamatoria crónica del tracto respiratorio muy compleja, que involucra diferentes tipos de células inflamatorias y estructurales, las cuales a su vez tienen la capacidad de liberar múltiples mediadores inflamatorios locales y sistémicos. La enfermedad es una respuesta inflamatoria anormal de los pulmones, principalmente al humo del cigarro (también gases y partículas nocivas) que conduce a una disminución lenta, progresiva e irreversible de la ventilación pulmonar. Las enfermedades cardiovasculares son unas de las comorbilidades más frecuentemente asociadas a la EPOC, aunque los mecanismos implicados en su desarrollo son aún desconocidos. En este estudio hemos investigado la posible relación entre el eje CXCR6/CXCL16 y la disfunción endotelial asociada a la EPOC. La citometría de flujo se utilizó para comparar la expresión de marcadores activación plaquetaria, expresión de CXCL16/CXCR6 en plaquetas y la expresión de CXCR6 en leucocitos de pacientes de EPOC versus controles sanos. Estos estudios revelaron que los pacientes de EPOC presentan mayor número de plaquetas activadas (PAC-1+) con mayor expresión de P-selectina, CXCL16 y CXCR6 además de un incremento en la adhesión leucocito-plaqueta comparado con los controles. Estos pacientes también presentaron mayor expresión de CXCR6 en leucocitos mononucleares. Basándonos en estos resultados procedimos a ampliar el estudio trasladando los resultados obtenidos a estudios in vitro en células humanas. En primer lugar, en condiciones fisiológicas de flujo, se observó que los leucocitos mononucleares procedentes de pacientes de EPOC presentaban mayor adhesividad al endotelio arterial estimulado con humo de tabaco. A continuación, se observó que la estimulación con extracto de humo de tabaco (EHT) promueve un aumento en la expresión arterial de CXCL16 tanto a nivel de ARNm y como de proteína en HUAECs. En condiciones fisiológicas de flujo, CXCL16 medió la adhesión de leucocitos mononucleares al endotelio arteriolar estimulado con EHT, dicho aumento en la adhesión fue significativamente inhibido mediante el bloqueo de la actividad de CXCL16. El aumento de la expresión de CXCL16 inducida por EHT fue dependiente de la expresión de Nox5 y la subsiguiente activación de la vía RhoA/p38-MAPK/NF?B. Mediante microscopia intravital, el reclutamiento leucocitario en animales expuestos a HT durante 3 días fue evaluado. Nuestros resultados indican que el humo de tabaco produjo inflamación pulmonar y además incrementó las interacciones leucocito-endotelio en el cremaster de ratón, poniendo de manifiesto una mayor inflamación sistémica. Cabe destacar que estas respuestas fueron significativamente reducidas en ratones deficientes en el receptor de CXCL16 (CXCR6). En este estudio se presentan las primeras evidencia de aumento de expresión de CXCR6 en plaquetas y leucocitos circulantes con pacientes de EPOC, lo que puede constituir un nuevo marcador pronóstico de enfermedades cardiovasculares asociadas a esta patología. Además el bloqueo del eje CXCL16/CXCR6 podría constituir una nueva diana terapéutica en la prevención y tratamiento de las enfermedades cardiovasculares asociadas a la EPOC.