Caracterización de la proteína chd8 en mamíferos

Resumen

Origen y Objetivos de la Tesis: En el núcleo celular eucariótico, el DNA se encuentra empaquetado formando una estructura altamente organizada denominada cromatina. Esta estructura no sólo posibilita el perfecto acomodo de casi 2 m de DNA dentro de un núcleo de 10 micras de diámetro (caso humano), sino que además constituye un sistema dinámico a través del cual la célula puede ejercer su control sobre las principales funciones genéticas nucleares: la transcripción, la replicación, la reparación y la recombinación. La unidad repetitiva básica de la cromatina es el nucleosoma. Cada nucleosoma está formado por un octámero de histonas, proteínas de naturaleza básica que contribuyen a la estabilización del DNA. Concretamente, cada nucleosoma consta de un heterotetrámero central formado por dos moléculas de histona H3 y dos de H4, y dos heterodímeros flanqueantes de histonas H2A y H2B. Alrededor de esta estructura prácticamente cilíndrica se enrollan unos 147 pb de DNA, lo que supone casi dos vueltas completas de éste. El remodelado de la cromatina es un concepto muy amplio que sirve para englobar todos aquellos cambios en la organización de la cromatina que permiten a la célula controlar el acceso al DNA de las maquinarias implicadas en las diferentes funciones en las que éste participa. Aunque estas funciones son principalmente las anteriormente mencionadas, el remodelado de la cromatina también interviene decisivamente en la regulación de procesos como la apoptosis o la organización del genoma durante la división celular, por lo que va a representar un papel fundamental en el control del ciclo celular y en el desarrollo de los organismos superiores. Se han descrito tres mecanismos por los que la célula puede ejercer el remodelado de su cromatina. El primero implica el reemplazo de alguna de las histonas nucleosómicas normales (o canónicas) por otras variantes con funciones específicas, el segundo emplea toda una batería de modificaciones covalentes y reversibles de las colas de las histonas nucleosómicas y el tercero engloba multitud de complejos multiproteicos capaces de modificar la disposición de los nucleosomas en la fibra de cromatina utilizando la energía de la hidrólisis del ATP. Centrándonos ya en el último de los mecanismos, cada uno de esos complejos alberga como subunidad catalítica una ATPasa dependiente de DNA de la familia Snf2. El rasgo más distintivo de las ATPasas de la familia Snf2 es el dominio SNF2_N, dominio responsable de la hidrólisis de ATP que conforma, junto al dominio HELICc, el centro catalítico de estas enzimas. El análisis de la homología existente entre las secuencias de los centros catalíticos de sus miembros ha permitido subdividir esta familia en 24 subfamilias. Las ATPasas que constituyen el núcleo de los complejos remodeladores mejor estudiados hasta la fecha se encuadran en las subfamilias Snf2, ISWI, Ino80, Swr1, CHD1, Mi-2 y CHD7. La subfamilia CHD7 incluye la proteína KIS-L de Drosophila y sus ortólogos de mamíferos CHD6, CHD7, CHD8 y CHD9. Al inicio de este trabajo algunos autores ya habían comenzado la caracterización molecular y funcional de KIS-L. Los datos preliminares verificaban su condición de remodelador de la cromatina dependiente de ATP y esbozaban su importante papel durante el desarrollo embrionario. Sin embargo, la información disponible acerca de los cuatro ortólogos era prácticamente nula y, de hecho, ni tan siquiera sus cDNAs completos se encontraban disponibles. Esta falta de conocimiento fue la razón que impulsó esta tesis doctoral acerca de la función de la proteína CHD8. Entre nuestros principales objetivos estaba caracterizar el patrón de expresión de la proteína, identificar genes gobernados por ella, describir sus posibles interacciones con otros factores proteicos y, en última instancia, tratar de desvelar el mecanismo molecular por el que CHD8 controla la expresión génica. Desarrollo de la Tesis: Respecto a la caracterización básica del gen CHD8, básicamente nuestra tarea consistió en construir un cDNA completo (verificando su existencia dentro de la célula) y en determinar sus niveles de expresión en órganos y líneas celulares mediante experimentos de RT-PCR y Northern Blot, así como mediante hibridación in situ en embriones de ratón. En este sentido, y al contrario de lo que ocurre con el resto de ortólogos, la expresión del CHD8 resultó ser ubicua. Una vez verificada la especificidad de los anticuerpos ¿-CHD8 que nos propusimos desarrollar, procedimos a estudiar mediante experimentos de Western Blot la distribución de la proteína. De esta manera complementamos el análisis de expresión que habíamos realizado al nivel transcripcional. En consonancia con lo que ocurría con su mRNA, los anticuerpos detectaron CHD8 en todos los órganos y líneas analizados. Además, nuestros experimentos de inmunocitoquímica con fluorescencia revelaron que la proteína, cuyas secuencias de localización nuclear también describimos, se situaba exclusivamente en el núcleo celular y claramente excluida de los nucléolos. Nuestra principal estrategia para estudiar la función de CHD8 consistió en generar líneas estables con niveles regulables de la proteína para después, con la ayuda de micromatrices, efectuar un análisis transcriptómico comparativo, con y sin ella, capaz de revelarnos los genes que regula. Nuestros primeros experimentos con dichas líneas revelaron que la reducción de CHD8 provocaba una moderada pero evidente ralentización del ciclo celular. Para saber exactamente qué fase del ciclo celular resultaba afectada por la reducción del nivel de CHD8, realizamos análisis mediante citometría de flujo en ausencia y presencia de la proteína. Los resultados de estos experimentos, junto con los datos obtenidos a partir de ensayos de incorporación de BrdU en las líneas estables, y que mostraban que la caída de CHD8 reducía sensiblemente esta incorporación, nos llevaron a la conclusión de que la proteína actuaba favoreciendo la transición G1/S del ciclo celular. Posteriormente, nuestro análisis transcriptómico comparativo desveló que la disminución del nivel habitual de CHD8 provocaba un aumento de la expresión en 10 genes y una reducción de la expresión en otros 31. De todos los genes cuya expresión se veía modificada en ausencia de cantidades normales de CHD8, nos fijamos especialmente en aquellos cuya expresión anómala pudiera explicar los defectos observados previamente en la proliferación celular. Los genes dependientes del factor transcripcional E2F1 CCNE2 y TYMS resultaban bastante atractivos teniendo en cuenta su papel decisivo en la transición G1/S del ciclo celular y la disminución en su expresión detectada en nuestro análisis transcriptómico comparativo. Nuestra primera aproximación para averiguar si los genes CCNE2 y TYMS estaban regulados de forma directa por CHD8 consistió en construir un plásmido capaz de expresar el gen de la luciferasa bajo el control del promotor del gen CCNE2, pCycE2, y co-transfectarlo junto con cantidades crecientes del vector pAdRSV-Sp-FLAG-CHD8, capaz de expresar la proteína CHD8. La actividad luciferasa medida 36 h después de cada transfección aumentaba conforme más plásmido pAdRSV-Sp-FLAG-CHD8 se introducía, llegando a cuadruplicarse al utilizar 0,7 µg. Nuestro siguiente paso consistió en utilizar nuestros anticuerpos ¿-CHD8 para realizar experimentos de ChIP que refrendaran in vivo no sólo esta asociación de CHD8 al promotor del gen CCNE2, sino también su asociación a una región análoga del gen TYMS. Los resultados fueron positivos. Además, y como cabía esperar, la cantidad de cromatina inmunoprecipitada de la región 5' de ambos genes se reducía sensiblemente cuando disminuíamos en las células los niveles de CHD8. Tras este resultado, quisimos investigar la distribución precisa de nuestra proteína a lo largo del gen CCNE2, en células C-33A (las células de las que derivaban nuestras líneas estables). En este sentido, nuestros experimentos de ChIP mostraron un enriquecimiento de CHD8 tanto en el promotor como en la región 5' del gen que, no obstante, disminuye poco a poco a medida que avanzamos hacia su región 3'. A continuación se procedió a investigar si la asociación de CHD8 con el promotor del gen CCNE2 es dependiente de transcripción. Teniendo en cuenta que el gen CCNE2 sólo se expresa durante la transición G1/S y la propia fase S del ciclo celular, lo que hicimos fue llevar a cabo ensayos de ChIP sobre células HeLa sincronizadas tanto en la transición G1/S como en las fases S, G1 temprana y G1 tardía del ciclo. Los experimentos indicaron que CHD8 se mantiene unida a la región 5' de CCNE2 incluso en aquellas fases en las que éste no se transcribe. Al comprobar qué ocurría con la RNAPII, los ensayos de ChIP realizados con un suero capaz de inmunoprecipitar todas sus variantes (¿-RNAPII N20) demostraron que, si bien durante la transición G1/S, y debido a la activación de CCNE2, su presencia se incrementa a lo largo de todo el gen, realmente en su región 5' se pueden detectar niveles parecidos de la enzima en todo momento. Esto sugiere que la RNAPII permanece parada en esta región mientras el gen CCNE2 permanece transcripcionalmente inactivo. Teniendo en cuenta el último resultado, y como primera aproximación para tratar de desvelar el mecanismo por el que CHD8 controla la expresión de sus genes diana, quisimos averiguar mediante co-inmunoprecipitación en la línea C-33A si CHD8 interacciona con la RNAPII. Las formas de la RNAPII que co-inmunoprecipitaron con CHD8 fueron tan sólo las fosforiladas, lo que sugiere la participación de CHD8 en el proceso de elongación de la transcripción. Para soportar esta hipótesis, decidimos investigar si la disminución de CHD8 volvía a las células C-33A-9 hipersensibles a inhibidores contrastados de la elongación como el Flavopiridol o el 5,6-Diclorobenzimidazol-1-ß-D-ribofuranósido (DRB), dos drogas que bloquean este proceso actuando sobre la subunidad CDK9 del complejo P-TEFb. Y esto fue exactamente lo que observamos. En otro orden de cosas, las ATPasas dependientes de DNA de la familia Snf2 presentan una serie de dominios adicionales que permiten su interacción no sólo con la cromatina, sino también con otras subunidades de sus propios complejos multiproteicos, factores transcripcionales, etc. Así pues, decidimos investigar las interacciones mediadas por estos dominios como aproximación complementaria para el estudio de la función de CHD8. Una de las funciones de los dominios CHROMO es mediar la interacción entre las proteínas que los poseen y ciertas lisinas metiladas de las colas de las histonas. Así, los dominios CHROMO de la proteína CHD1, que se disponen en tándem de manera similar a los de CHD8, son capaces de interaccionar con la histona H3 siempre que ésta se encuentre trimetilada en su lisina 4 (H3K4me3). Para verificar si los dominios CHROMO de CHD8 eran también capaces de interaccionar con este tipo de modificación covalente de la histona H3, expresamos en E. coli tres fusiones GST, una con el primer dominio CHROMO de CHD8 (residuos 629 a 715), otra con el segundo (residuos 710 a 785) y otra con los dos juntos (residuos 629 a 785), tal y como se encuentran en la proteína. Tras incubar in vitro cada una de estas tres proteínas recombinantes con péptidos biotinilados correspondientes a los 21 primeros aminoácidos de la histona H3 y que podían estar, o bien sin modificar, o bien metilados en su lisina 4 (di (H3K4me2) o trimetilados (H3K4me3)) o en su lisina 9 (dimetilados (H3K9me2)), descubrimos, entre otras cuestiones, que los dos dominios en tándem (la disposición fisiológica) interaccionaban mucho mejor con el péptido H3K4me2. Este resultado planteaba la posibilidad de que CHD8 se estuviera uniendo a la modificación covalente H3K4me2 con el objetivo de promover una última metilación que diera lugar a la modificación H3K4me3, pero los experimentos de ChIP llevados a cabo en nuestras líneas estables para comprobar si la disminución de CHD8 podía influir en los niveles de estas dos marcas en la región 5' del gen CCNE2 resultaron negativos. Así pues, podemos decir que la demostración de que CHD8 interacciona con la modificación covalente H3K4me2, unida al hecho de que la proteína no resulte necesaria para la metilación de las lisinas 4 de las histonas H3 de la región 5' del gen CCNE2, concuerdan con un posible papel de la modificación H3K4me2 en el reclutamiento de CHD8 hacia el gen CCNE2. Por otra parte, todas las ATPasas de la subfamilia CHD7 poseen en su extremo carboxilo terminal uno o dos dominios BRK de función prácticamente desconocida. Con el objetivo de aprender más sobre este tipo de dominio y, al mismo tiempo, revelar otras funciones de CHD8, decidimos llevar a cabo un escrutinio de doble híbrido en S. cerevisiae con los dos dominios BRK de CHD8. El rescate y posterior secuenciación de los cDNAs situados en el vector presa de cada clon positivo reveló que todos codificaban la misma proteína de la cromatina, HMG20a. Para terminar, y tras haber analizado interacciones mediadas por los dominios CHROMO y BRK de CHD8, exceptuando su región catalítica, altamente conservada, el único fragmento de la proteína con el que consideramos factible rastrear nuevas interacciones fue el que abarca desde el final del dominio HELICc hasta el comienzo del primero de los dos dominios BRK, y que incluye un dominio SANT. El escrutinio de doble híbrido realizado con este fragmento reveló la interacción de CHD8 con los factores transcripcionales HOXA10, HOXA11 y HOXD10, interacción que fue refrendada posteriormente mediante experimentos de co-inmunoprecipitación. Conclusiones de la Tesis: Las conclusiones más importantes de esta tesis doctoral son: 1. Se ha determinado y verificado la secuencia humana completa del gen CHD8. El estudio de la expresión de dicho gen muestra la presencia de su mRNA y de su correspondiente proteína en todos los órganos y líneas celulares analizadas. De igual forma, el mRNA de CHD8 se encuentra distribuido de manera ubicua en los dos estadios embrionarios examinados en ratón (8,5 y 10,5 dpc). 2. CHD8 es una proteína nuclear asociada a la cromatina. 3. CHD8 favorece la transición G1/S del ciclo celular. 4. CHD8 activa de una manera directa la transcripción de los genes CCNE2 y TYMS, genes controlados por el factor transcripcional E2F1 y claves para la transición G1/S del ciclo celular. Este hecho puede explicar la conclusión anterior. 5. CHD8 se asocia in vivo al promotor y a la región 5' transcrita del gen CCNE2. Su presencia disminuye drásticamente conforme nos acercamos a la región 3'. 6. CHD8 interacciona in vivo con las dos formas fosforiladas de la RNAPII. Este hecho, sumado al contenido de la anterior conclusión y a la observación de que células de la línea C-33A-9 con reducidas cantidades de CHD8 resultan hipersensibles a inhibidores de la elongación como el DRB o el Flavopiridol, sugiere un papel para dicha proteína al inicio de la fase de elongación de la transcripción de los genes que controla. 7. Los dominios CHROMO de CHD8 se unen preferentemente a la modificación covalente H3K4me2 in vitro. Dado que la disminución de CHD8 en la línea C-33A-9 no afecta ni a los niveles de esta marca ni a los de la íntimamente relacionada H3K4me3, el sentido de la interacción podría ser el reclutamiento de la proteína a los promotores de los genes cuya transcripción hace posible. 8. CHD8 interacciona con las proteínas HMG20a, HOXA10, HOXA11 y HOXD10 mediante el sistema de doble híbrido en S. cerevisiae.