Caracterización fenotípica y molecular de cepas de "Pasteurella multocida" aisladas de lesiones neumónicas porcinas

Resumen

Pasteurella multocida es considerada actualmente uno de los principales agentes etiológicos de enfermedades respiratorias porcinas, entre ellas, la rinitis atrófica y la pasteurelosis neumónica, en la que suele actuar como un agente secundario, causando serias pérdidas económicas en las explotaciones porcinas, al ocasionar retrasos en el crecimiento de los animales, cuando no su muerte. Nuestro principal objetivo en la presente tesis doctoral fue aislar y caracterizar cepas de P. multocida a partir de las muestras clínicas de pulmones neumónicos tomadas de cerdos sacrificados en el matadero. A partir de 452 muestras procedentes de Castilla y León, Cantabria y Cataluña, recogidas durante el periodo 2003-2004, se aislaron y estudiaron un total de 270 cepas de P. multocida, a las que se le sumaron otras 76 previamente obtenidas entre los años 1987 y 1988. Las 346 cepas totales fueron caracterizadas mediante métodos fenotípicos y genotípicos. De esta forma, las características macroscópicas desarrolladas en los medios de cultivo utilizados permitieron el aislamiento de este microorganismo. La identificación bioquímica permitió ratificar la subespecie P. multocida subsp multocida como la presente en los aislados obtenidos; de igual forma, un estudio más profundo permitió agrupar las cepas en tres biovares diferentes. Además se realizó una determinación bioquímica mediante el sistema comercial de identificación rápida API, pudiendo ser considerada una herramienta complementaria en la identificación de estas cepas, el sistema API 20 NE, además, los resultados en conjunto obtenidos a partir de los 4 sistemas de identificación, permitieron determinar una diversidad fenotípica, donde prevaleció un patrón bioquímico que agrupo a 15 de las 60 cepas analizadas. Mediante procedimientos no serológicos se logró agrupar la casi totalidad de las cepas bajo el tipo capsular A y sólo tres cepas fueron clasificadas como D. En la detección de la susceptibilidad a la acción del complemento la mayoría cepas fueron resistentes al suero, siendo del tipo capsular A, sin embargo, este fenómeno también fue observado en cepas del tipo capsular D, por lo tanto, los altos valores de resistencia obtenidos frente al suero podrían ser considerados como un indicativo de su virulencia. La resistencia in vitro que demostraron las 195 cepas seleccionadas frente a los 20 antimicrobianos, fue escasa, excepto para la oxitetraciclina y las sulfonamidas. Según los resultados obtenidos, el ceftiofur, florfenicol y enrofloxacina fueron los antibióticos más eficaces para el tratamiento de las infecciones causadas por P. multocida subsp multocida de origen porcino en España. La técnica ELISA permitió detectar 67 cepas toxigénicas de P. multocida subsp. multocida entre las 346 cepas analizadas. Estos resultados fueron congruentes (a excepción de 2 cepas) con los obtenidos a partir de la caracterización genotípica mediante PCR de cepas toxigénicas y con los resultados obtenidos en el ensayo de la actividad dermonecrótica, donde se demostró que 5 de las cepas seleccionadas y previamente caracterizadas mediante ELISA y PCR, producían in vivo la lesión característica sobre la piel del cobayo. La caracterización genotípica mediante el uso de la técnica PCR confirmó la identificación fenotípica de los aislados como P. multocida. Se determinó que el tipo capsular A (99,1%) fue el predominante entre estos aislados analizados. Además, para cada una de las cepas analizadas se detectó (en diferente porcentaje) la presencia y/o ausencia de un grupo de genes relacionados con los factores de virulencia relacionados con la captación de hierro codificados por los genes tonB, hgbA, sodA, sodC detectados en el 100% de las cepas, el hgbB en el 63% y el tbpA en ninguna de las cepas, de igual forma el factor de adherencia codificados por los genes ptfA, nanB, oma87, ompH, psl, fueron detectados en la totalidad de las cepas, el nanH en el 97,7% y pfha en el 46,8% y la producción de dermonecrotoxina codificada por el gen toxA, detectada en 19,9% (69 cepas). El poder discriminatorio del PFGE permitió agrupar las cepas en 18 cluster, que agruparon a los 76 patrones de restricción, estableciéndose la relación genética que existe entre ellas, siendo el patrón 50 el de mayor predominancia entre las cepas analizadas.