Precision medicine in Merkel cell carcinoma and advanced cutaneous melanomaimplications of molecular characterization in diagnosis, prognosis and targeted therapy

Resumen

En este trabajo se han estudiado dos tipos de cáncer de piel agresivos; el carcinoma de células de Merkel (MCC) y el melanoma cutáneo avanzado. Su estudio se ha abordado partiendo de la caracterización molecular de los tumores mediante el uso de técnicas de secuenciación de ADN, cuyos resultados se han utilizado posteriormente para desarrollar posibles aplicaciones traslacionales para el diagnóstico y el tratamiento. Esta tesis se ha desarrollado partiendo de la hipótesis de que la caracterización molecular de casos de cáncer individuales puede conducir a la detección de mecanismos de enfermedad específicos. Esto podría desembocar en la identificación de dianas terapéuticas, así como de biomarcadores que puedan apoyar el diagnóstico y el pronóstico, o predecir la respuesta y la evolución ante determinados tratamientos. Las firmas mutacionales presentes en las células tumorales podrían originar redes de señalización aberrantes que, a su vez, podrían determinar la evolución clínica de un cáncer y su respuesta a diferentes terapias. Por lo tanto, la caracterización molecular del cáncer podría ser clave para conseguir una selección racional de los tratamientos. Durante la realización de este trabajo, la información obtenida mediante técnicas de secuenciación se ha utilizado posteriormente para inferir rutas de señalización, procesos biológicos y/o biomarcadores con un posible papel en el desarrollo del melanoma o del MCC. Algunos de estos mecanismos y marcadores podrán, tal vez, ser utilizados en un futuro cercano para establecer pronósticos y diagnósticos más precisos, e incluso, para dirigir el uso de determinadas terapias. PROCEDIMIENTOS, RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Teniendo en cuenta que el carcinoma de células de Merkel es relativamente poco conocido, y ante los escasos datos existentes acerca de los mecanismos moleculares implicados en esta enfermedad, su estudio se abordó mediante la secuenciación del exoma completo de una cohorte de 15 casos clínicamente caracterizados. Este abordaje exploratorio aportó una visión global de las mutaciones somáticas presentes en los tumores, cuyo análisis e interpretación posteriores desvelaron una serie de procesos biológicos y de mecanismos moleculares significativamente alterados en nuestra cohorte. La mayor parte de estos procesos no habían sido hasta ahora relacionados con este cáncer. Aproximadamente la mitad de los casos de nuestra cohorte tenían el DNA del Poliomavirus de las células de Merkel (MCPyV) integrado en el genoma de las células tumorales. Las características genómicas esta serie de casos indicaban la presencia de dos poblaciones claramente diferentes: mientras que los casos que expresaban las proteínas virales tenían bajas tasas de mutación, los casos en los que no detectamos antígenos del poliomavirus tenían índices mutacionales muy altos, acompañados de la firma mutacional atribuida a la radiación ultravioleta. Esto sugería la existencia de dos etiologías distintas; el virus y la radiación ultravioleta. El análisis bioinformático de los datos mutacionales reveló una serie de genes mutados con una frecuencia mayor de la esperable por azar, así como varios procesos biológicos y rutas de señalización celular significativamente alteradas en nuestra cohorte. La interpretación mecanística de estos datos nos llevó a seleccionar una serie de marcadores que sirvieran como indicadores de la actividad de estas rutas y mecanismos que habíamos encontrado alterados. Estos marcadores fueron analizados mediante inmunohistoquímica en secciones de tumores, lo cual nos permitió extender nuestro estudio a 48 casos con seguimiento clínico. Mediante este análisis encontramos mecanismos de enfermedad compartidos entre las dos etiologías, a pesar de las notables diferencias genéticas existentes entre ellas. Por otro lado, encontramos algunos mecanismos de enfermedad prácticamente exclusivos de los casos MCPyV-negativos. Por último, descubrimos que dos de los biomarcadores seleccionados, P-CREB y P-STAT, que formaban parte de mecanismos de enfermedad comunes, estaban fuertemente asociados a una menor superviviencia de los pacientes. Sin embargo, un posterior análisis multivariante en el que se incluyeron otros factores que podían estar afectando a la supervivencia, reveló que sólo P-CREB era un factor pronóstico independiente del estadio de la enfermedad, el sexo, la edad, la integración del poliomavirus en el genoma tumoral y la expresión de P-STAT. Para estudiar el melanoma cutáneo, se eligió una técnica de secuenciación dirigida para analizar las mutaciones presentes en las zonas codificantes de un grupo de 217 genes previamente seleccionado. Dado que esta enfermedad es mucho más conocida y descrita que la anterior, tanto a nivel clínico como molecular, nos basamos en la literatura para decidir los genes que nos interesaba estudiar. Mediante un primer análisis in silico de las mutaciones presentes en nuestra selección de genes en cohortes de paciente independientes, encontramos una media de 3,74 genes mutados que podían ser asociados con un inhibidor, directo o indirecto, en uso en la clínica. Además, identificamos un total de 8 grupos de genes y rutas de señalización frecuentemente alterados en estos pacientes. Posteriores estudios ex vivo nos permitieron analizar los efectos sobre la proliferación celular de inhibidores escogidos en base a las mutaciones encontradas en cada caso. De esta forma comprobamos, en primer lugar, que la combinación de drogas era más eficaz que la monoterapia. En segundo lugar, que algunos inhibidores independientes de la ruta MAPK, que no afectaban a la activación de ERK1/2, tenían importantes efectos antiproliferativos. En tercer lugar, que utilizando estos inhibidores junto con los habituales inhibidores de MEK y BRAFV600E, utilizados habitualmente en la clínica, podíamos potenciar sus efectos. Por último, que el efecto de las drogas sobre una línea celular estaba condicionado por el conjunto de mutaciones presentes en ella. Estos estudios fueron complementados con experimentos in vivo, en los que utilizamos ratones con tumores en xenograft, por un lado, derivados de líneas celulares y, por otro lado, derivados de lesiones tumorales. Estos experimentos nos sirvieron para constatar que éramos capaces de reducir el crecimiento tumoral utilizando fármacos que no inhibían la activación de ERK1/2, igual que ocurría con la proliferación celular. Además, comprobamos que la combinación de drogas mejoraba los resultados de la monoterapia, confirmando de nuevo los resultados obtenidos ex vivo. CONCLUSIONES. Conclusiones del proyecto 1: 1. Se ha diseñado un abordaje novedoso y original para caracterizar molecularmente tumores de MCC, consistente en la combinación de análisis mutacionales e inmunohistoquímicos. 2. Las características genómicas de los tumores indican la existencia de 2 subtipos principales de MCC, lo que, a su vez, sugiere la existencia de 2 etiologías: a. Un subtipo se caracteriza por tener el ADN del MCPyV integrado en el genoma y presentar bajas tasas mutacionales. b. El otro subtipo se caracteriza por carecer de antígenos virales y presentar altas tasas mutacionales, acompañadas de firma ultravioleta. 3. En nuestra cohorte, se han encontrado significativamente alterados varios procesos biológicos y rutas de señalización que no habían sido hasta ahora relacionados con MCC. 4. A pesar de las diferencias genómicas, los casos positivos y negativos para el poliomavirus parecen desarrollar mecanismos de enfermedad comunes: RB, p53, p63, NFAT, P-STAT y P-CREB. 5. La expresión de P-CREB y P-STAT correlaciona significativamente con un peor pronóstico en un análisis univariante. 6. En un análisis multivariante, la expresión de P-CREB ha sido identificada como un marcador pronóstico independiente (del sexo, la edad, el estadio de la enfermedad, P-STAT y la presencia o ausencia del MCPyV). Conclusiones del proyecto 2: 1. Se ha desarrollado una plataforma de análisis mutacional dirigido para caracterizar casos de melanoma cutáneo en un tiempo compatible con la práctica clínica (aproximadamente 15 días). 2. Cada lesión tumoral ha mostrado un perfil mutacional único y una media de entre 3 y 4 genes mutados por caso que pueden ser, directa o indirectamente, asociados con un inhibidor específico. 3. Las terapias que combinan inhibidores de mecanismos dependientes e independientes de MAPK han sido más efectivas que las monoterapias, tanto ex vivo como in vivo. 4. Utilizando este abordaje, se podrían sugerir terapias dirigidas para casos de melanoma avanzado independientemente de la presencia o ausencia de mutaciones en BRAF. 5. Las terapias dirigidas han sido más efectivas ex vivo cuando se han utilizado sobre una línea celular con un perfil mutacional adecuado.