Caracterización de los factores de transcripción nfat en astrocitosregulación y funciones

Zusammenfassung

Los astrocitos son una pieza clave en el mantenimiento de la homeostasis cerebral. Entre sus muchas funciones destaca el aporte de nutrientes y antioxidantes a las neuronas, además de tener un papel activo en las sinapsis nerviosas. Por otra parte, los astrocitos participan en la neuroinmunidad junto con la microglía. En este sentido, tienen una elevada sensibilidad a estímulos nocivos o patológicos, ante los que reaccionan activándose y liberando mediadores inflamatorios que afectan a la supervivencia neuronal. Por tanto, la comprensión de las rutas intracelulares que intervienen en la activación astrocitaria en distintas condiciones neuroinflamatorias, puede contribuir al desarrollo de nuevas terapias contra enfermedades neurodegenerativas en las que interviene una respuesta inmune. El factor nuclear de células T activadas (NFAT) es una familia de factores de transcripción implicada en la proliferación, diferenciación y activación de células inmunes. Su activación depende de aumentos de Ca2+ intracelular y de la actividad fosfatasa de calcineurina, una enzima muy abundante en el SNC. Los astrocitos responden a multitud de estímulos inflamatorios aumentando sus niveles de Ca2+ intracelular, y en su estado activado sobreexpresan calcineurina. Por tanto, nuestra hipótesis de trabajo es que el sistema NFAT es funcional en el astrocito, y podría mediar la transcripción de genes involucrados en la adquisición y/o mantenimiento de su fenotipo reactivo; lo que tendría consecuencias para la supervivencia neuronal. Para la caracterización del sistema NFAT en el astrocito utilizamos tanto cultivos primarios como modelos murinos de astrogliosis con un fuerte componente inflamatorio: la inyección intracerebral de ácido kaínico (KA) y la lesión mecánica cortical. En cultivos primarios de astrocitos describimos por primera vez la expresión y funcionalidad de la isoforma NFATc1. Para ello aplicamos técnicas tales como: RT-PCR cuantitativa, Western blot, inmunofluorescencia y transfección de un plásmido reportero dependiente del promotor de NFAT. Además, detallamos que NFATc1 es activado por lesión mecánica a través de la liberación de ATP y movilización de Ca2+ por dos subtipos específicos de receptores purinérgicos metabotrópicos. Por otra parte, mediante técnicas inmunohistoquímicas encontramos evidencias de una sobreexpresión de NFATc3 en una subpoblación de astrocitos reactivos en los dos modelos in vivo utilizados. Los astrocitos reactivos NFATc3(+) están presentes en regiones de intensa neurodegeneración tanto en corteza como en hipocampo. También, mediante RT-PCR y Western blot, observamos la expresión de las dianas de NFAT COX-2 y RCAN1-4 en hipocampos expuestos a daño excitotóxico por inyección de KA. Además, la inducción de RCAN1-4 fue específica de astrocitos hipocampales, sugiriendo que la sobreexpresión de NFATc3 va precedida por una activación del sistema NFAT en el astrocito. En apoyo de esta última idea, hallamos un aumento del ARNm de NFATc3 tras la adición de ATP a cultivos primarios de astrocitos. Esta inducción fue bloqueada por inhibidores específicos de la activación de NFAT. Finalmente, también mediante técnicas inmunohistoquímicas caracterizamos la subpoblación de astrocitos reactivos NFATc3(+) ubicada en la región proximal de la cicatriz glial cortical causada por una lesión penetrante. Esta subpoblación presenta una expresión disminuida de GFAP y coincide ampliamente con la población de astrocitos reactivos vimentina(+)/nestina(+), pero no con la glía NG2; por lo que concluimos que NFATc3 puede estar vinculado a un estado astrocitario desdiferenciado o expresarse en poblaciones de progenitores que migran hacia el foco de lesión. En definitiva, nuestros resultados aportan datos que implican al sistema NFAT en la reactividad de los astrocitos en distintos tipos de neuropatologías con un componente neuroinflamatorio. Futuros trabajos deberán esclarecer si la activación astrocitaria mediada por NFAT tiene relación con la capacidad neuroprotectora de los astrocitos reactivos, o con sus efectos deletéreos.