Propiedades de levaduras Saccharomyces y no Saccharomyces, aisladas de ambientes naturales

Resumen

Introducción A medida que se ha profundizado en el estudio e importancia que poseen las levaduras en la elaboración del vino, han surgido distintas propuestas y metodologías cuyo fin último era la mejora del proceso fermentativo; por eso la industria enológica de hoy en día prefiere emplear cultivos iniciadores en los procesos de vinificación, es decir una cepa conocida y tipificada que normalice la microbiota inicial, reduzca el número de cepas de Saccharomyces sp indígenas y controle el proceso de fermentación Así, para la elaboración de vinos de calidad, competitivos en el mercado, algunas bodegas de pago, se decantan por usar como cultivos iniciadores levaduras espontaneas aisladas de su propia bodega. La tendencia de la nueva enología es emplear levaduras a la carta, lo que ha llevado a algunas bodegas a un creciente interés por el uso de levaduras seleccionadas de sus propios mostos en fermentación, con la convicción de que al estar mejor adaptadas a la ecología de la zona, exhiben características fisiológicas particulares y realzan la peculiaridad de la variedad de uva (Csoma et al., 2010). De hecho la tipicidad de muchos mostos deriva de varios factores, incluida la presencia de cepas de levadura (Martínez et al., 2007). Capece et al., (2010), corroboran este hecho al asegurar que las cepas autóctonas serían las mejor adaptadas a las condiciones ambientales, e imprimirían un estilo localmente distintivo al vino. El empleo de microorganismos o de sus metabolitos para inhibir o destruir a microorganismos patógenos o alterantes, es un método de gran interés en la industria alimentaria. Los microorganismos empleados en el control biológico han de tener status GRAS (Generally Recognized As Safe), y entre los más habituales están las bacterias lácticas, ciertas levaduras e incluso algunos mohos que controlan el desarrollo de la biota del alimento, constituyendo una herramienta exenta de peligro para el consumidor (Santos y Marquina, 2004a) Desde hace años se ha estudiado el papel de las levaduras en el control biológico de agentes fitopatógenos en alteraciones postcosecha (Santos et al., 2008). La capacidad de síntesis de zimocinas no es exclusiva del género de Saccharomyces; y se extiende a otros como Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Sporidiobolus, Tilletiopsis, Zygosaccharomyces, etc. Aunque, las bases genéticas de los caracteres killer son variables, sus características son similares: proteínas sensibles al calor, estables y activas a pH ácidos. Contenido de la investigación En la primera parte de esta tesis doctoral se aborda el estudio de la ecología de levaduras de una bodega de pago para la posterior selección de una/s cepas/ de Sacharomyces sp con propiedades enológicas adecuadas para ser usadas como cultivo/s iniciador/es en su propio entorno enológico. Para ello era necesario conocer la biodiversidad a nivel de especie y/o cepa de las levaduras Saccharomyces y no Saccharomyces de los mostos en fermentación de las distintas variedades de uva que se vinificaban en el pago, así como estudiar las propiedades tecnológicas y actividades enzimáticas más relevantes de cada una de las cepas de Saccharomyces aisladas. Con las cepas que mostraron mejores aptitudes se microvinificaron mostos cedidos por la bodega y se evaluaron las características químicas y organolépticas de los vinos obtenidos. Las levaduras que dieron lugar a los vinos mejor puntuados se emplearon a escala industrial evaluándose su nivel de implantación en los depósitos inoculados, para conocer su competitividad frente a las levaduras espontáneas. Aunque la biodiversidad de las cepas de Saccharomyces que participaban en la fermentación de los mostos, no fue muy elevada, casi todas ellas estaban bien adaptadas a su entorno ecológico, ya que sus características enológicas eran adecuadas aunque susceptibles a elevadas concentraciones de etanol, ya que no iniciaban el proceso en presencia de 12 º alcohólicos. Respecto a sus actividades enzimáticas el 50% de las levaduras sintetizaron poligalacturonasas y en un menor porcentaje ß glucosidasa; ninguna de las cepas sintetizó proteasas ni ureasa, y en cambio algunas de ellas eran capaces de formar aminas biógenas en baja proporción. La resistencia al estrés afecta a la actividad fermentativa de las levaduras. Un parámetro que se emplea para determinarlo es la concentración de glucégeno y trehalosa intracelulares. Su estudio mostró diferencias significativas en el contenido y presentaron menores concentraciones de trehalosa aquellas que mostraron mayores vitalidades. La producción de ß-glucanasas y manoproteinas era cepa dependiente, observándose relación entre su contenido, que en ambos casos resultó mayor en el sobrenadante que en el extracto. Es conocido que los polisacáridos de las levaduras resultan eficaces para reducir la turbidez en vinos con quiebra proteica; en el presente estudio todas las cepas de levadura estudiadas excepto una, consiguieron reducir en más de un 50% la turbidez de los vinos, mostrando un comportamiento similar, al de la bentonita y al de un preparado comercial. Valorando los resultados anteriores, se consideró que de las 23 cepas estudiadas, cuatro presentaban las propiedades biotecnológicas idóneas para los procesos de vinificación, por lo que se eligieron para las elaboraciones y el estudiode lascaracterísticas químicas y sensoriales de los vinos obtenidos. El análisis de la varianza demostró que eran significativamente distintos en cuanto a su contenido en alcoholes superiores. Con respecto a la acidez volátil y contenido en ácido acético, en todos se obtuvieron niveles muy bajos, no superando en ningún caso 0,2 g/L. El índice de polifenoles totales, la intensidad colorante y la tonalidad de los 4 vinos fueron similares. Por último, el análisis sensorial, descartó los vinos elaborados con dos de ellas, quedando por tanto seleccionadas las cepas C y M como candidatas para elaborar los vinos en esa bodega de Pago. Estas dos cepas tuvieron un 100% de implantación, cuando se vinificó con ellas en la bodega, por lo que ambas podrían ser idóneas para su uso como cultivo iniciador. En la segunda parte de la memoria se recoge el estudio de la síntesis de zimocinas, péptidos antimicrobianos, en levaduras no Saccharomyces aisladas de ecosistemas naturales con la finalidad de su posible uso en el control de levaduras alterantes de alimentos y bebidas. Estas consideraciones llevaron a plantear en primer lugar el estudio de la síntesis de la toxina killer en levaduras no Saccharomyces aisladas en diferentes ecosistemas y pertenecientes a la colección de levaduras de la UCLM. De aquellas levaduras que producían la toxina se evaluó su capacidad de inhibir el crecimiento de ciertas levaduras alterantes, de bacterias lácticas y de cepas comerciales de Saccharomyces. Para la selección de dichos microrganismos se realizó un estudio bibliográfico exhaustivo que puso de manifiesto los retos y necesidades actuales de la industria alimentaria. Los resultados mostraron que de las 75 cepas probadas pertenecientes a 16 especies de las que se evaluó su capacidad para producir péptidos antimicrobianos., aunque 15 de ellas secretaban la toxina, Kluyveromyces thermotolerans presentó el espectro de acción más amplio, ya que logró inhibir la actividad de especies como Z. bailii,; D. hansenii , Y.lipolitica, P. membranaefaciens y Saccharomyces sp. No obstante, hubo otras levaduras que fueron eficaces en el control biológico, comoHanseniaspora osmophila, que impidió el desarrollo de tres especies Z. bailii, D. hansenii y Y. lipolitica. Una vez realizado el estudio a nivel de especie, se consideró importante estudiar si la sensibilidad de los microorganismos era cepa dependiente. Para ello, se realizaron ensayos con distintas cepas de las especies que se habían visto afectadas por la actividad killer. Así las tres cepas de Z. bailii ensayadas fueron sensibles a uno o más péptidos secretados por las cepas de K. thermotolerans Con respecto a la inhibición de las distintas cepas de D. hansenii, K thermotolerans controló el desarrollo de las tres individuos ensayados. Por tanto los resultados mostraron que en todos los casos, la sensibilidad de los microorganismos dependía del individuo, evidenciando una vez más el carácter cepa-dependiente de algunas características fenotípicas Conclusiones La selección de la cepa adecuada para cada tipo de fermentación es una estrategia muy importante para garantizar una fermentación correcta, así como para mejorar las características del vino final, ya que aunque es evidente que la calidad del vino va a estar claramente unida a la de la variedad y calidad de la uva, las levaduras producen metabolitos que distinguen y diferencian el producto obtenido. En el presente estudio se pone de manifiesto una vez más, la importancia de la selección de un cultivo iniciador propio del entorno ecológico de trabajo para la tipificación del producto obtenido. Por otra parte, en los últimos años se ha observado la presencia de péptidos con actividad antimicrobiana en levaduras Saccharomyces y no Saccharomyces. El hecho de que estos microrganismos, considerados amigables, sean capaces de controlar el crecimiento de agentes alterantes, ofrece una nueva perspectiva a la industria de alimentos, que permite incorporar en sus procesados y productos finales, procedimientos de biocontrol. En el presente estudio se puso de manifiesto que tanto la actividad antimicrobiana como la sensibilidad de los alterantes, posee carácter cepa dependiente, siendo una K thermotolerans la levadura que resultó más adecuada para su aplicación en el control biológico. Bibliografía ¿ ALBERGARIA, H., FRANCISCO, D., GORI, K., ARNEBORG, N., GÍRIO, F. (2010).Saccharomyces cerevisiae CCMI 885 secretes peptides that inhibit the growth of some non-Saccharomyces wine-related strains. Applied microbiology and biotechnology; 86(3):965-72ALONSO, A., BELDA, I., SANTOS, A., NAVASCUÉS, E., MARQUINA, D. (2015). Advances in the control of the spoilage caused by Zygosaccharomyces species on sweet wines and concentrated grape musts. 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