Función de la fosfatasa alcalina no específica de tejido en la pancreatitis aguda experimental y en la activación de macrófagos

Zusammenfassung

1. INTRODUCCIÓN Las fosfatasas alcalinas son una superfamilia de enzimas ampliamente distribuidas desde bacterias hasta humanos, capaces de hidrolizar grupos fosfato con liberación de fosfato inorgánico a pH alcalino. En humanos, las fosfatasas alcalinas se dividen en dos grupos: enzimas específicas de tejido, las cuales incluyen la isoenzimas intestinal (IAP), placentaria y de células germinales; y las isoformas de la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNAP). De hecho, el gen ALPL da lugar a tres variantes diferentes de la enzima, las cuales difieren solamente en la fracción glucosídica, concretamente, las isoformas de hígado, hueso y riñón, las cuales se encuentran mayoritariamente en estos órganos [1]. La TNAP es ampliamente conocida por su papel en el desarrollo de huesos y dientes. Las mutaciones en el gen de TNAP conducen a la hipofosfatasia [2, 3]. En el hígado, actúa inhibiendo la secreción biliar y se ve incrementada en caso de colestasis [4]. Además, la TNAP ha demostrado ser crucial en el crecimiento de axones, proliferación neuronal y diferenciación [5, 6]. Por otra parte, algunas evidencias señalan un posible papel neurotóxico de la TNAP, debido a la desfosforilación de la proteína tau fosforilada, un elemento clave en la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos [7]. El intestino del ratón adulto expresa mayoritariamente IAP aunque TNAP puede ser detectada en el intestino delgado y en mayor medida en el colon. IAP es una de las isoformas mejor caracterizadas. Está involucrada en la homeostasis intestinal, controla la absorción de lípidos [8] y la secreción de bicarbonato [9, 10], limita la translocación bacteriana a través de la mucosa y atenúa la toxicidad y la inflamación mediada por el lipopolisacárido bacteriano (LPS) [4, 11, 12]. Aparte de estas acciones, IAP también previene la disbiosis y las infecciones bacterianas [13]. Además, tanto en su forma endógena como su suplementación oral protege frente el síndrome metabólico [14]. Nuestro grupo de investigación ha descrito un incremento en la expresión de la TNAP en el colon en modelos de enfermedad inflamatoria intestinal, debido tanto al flujo de leucocitos hacia el tejido colónico inflamado como a la expresión aumentada en las células epiteliales [15-17]. En las células epiteliales del colon, a los cambios observados en el patrón de glucosilación, desde tipo hígado en condiciones basales hacia la isoforma tipo hueso o hígado tras la inflamación, se les ha atribuido un papel protector. [17]. La TNAP también ha demostrado afectar al metabolismo de la glucosa y la sensibilidad a la insulina al actuar sobre la producción de adipoquinas [18]. La pancreatitis aguda es uno de las enfermedades gastrointestinales más comunes que requiere de hospitalización [19]. Esta patología suele desarrollarse como una enfermedad moderada y autolimitada (80%), pero a veces puede progresar de manera rápida e incluso fulminante, con un incremento del riesgo de mortalidad substancial [20]. La pancreatitis aguda puede ser causada por una gran variedad de estímulos lesivos, como los cálculos biliares, el consumo excesivo de alcohol y las mutaciones en el gen que codifica el tripsinógeno [21]. Esta enfermedad implica una activación prematura de las enzimas digestivas y la autofagia del páncreas con el consiguiente daño y el reclutamiento de células del sistema inmune en respuesta [22, 23]. Las células inmunes implicadas en la respuesta inflamatoria en la pancreatitis aguda son las células acinares pancreáticas, las células endoteliales, los linfocitos, los monocitos/macrófagos y los neutrófilos [24]. Los últimos representan la primera línea de defensa y son reclutados hacia el espacio intersticial pancreático, seguidos de los monocitos [22, 25]. Además, se han descrito tanto en modelos animales de pancreatitis aguda como en pacientes de esta enfermedad la existencia de cambios en la permeabilidad intestinal, lo cual se correlaciona con la severidad de la patología [26]. Por su parte, la sepsis/endotoxemia es una de las causas de muerte más comunes en las unidades de cuidado intensivo. La sepsis se define como una disfunción orgánica capaz de poner en riesgo la vida y que está provocada por una respuesta inmune alterada a una infección [27]. Asimismo, se asocia con una enorme producción de citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias, siendo los macrófagos uno de los principales productores de estos mediadores [28]. La TNAP se expresa en células del sistema inmune. En los linfocitos B, la TNAP se ha relacionado con el proceso de diferenciación hacia células secretoras de anticuerpos [29, 30]. En los neutrófilos, esta enzima se ha localizado en las vesículas secretoras [31]. Recientemente, nuestro grupo de investigación ha arrojado algo de luz sobre el papel de la TNAP en las células T, por medio de un mecanismo que parece estar de nuevo relacionado con las modificaciones en la glucosilación [32]. Sin embargo, es poca la información que se conoce relativa a la función de la TNAP en los neutrófilos y los macrófagos. 2. OBJETIVOS Basado en lo descrito con anterioridad, propusimos 2 objetivos fundamentales en esta tesis doctoral: 1. Evaluar el papel de TNAP en enfermedades relacionadas con la inflamación: pancreatitis aguda y endotoxemia/sepsis 2. Caracterizar la función inmunomoduladora de TNAP en células inmunes 3. MATERIAL Y MÉTODOS Para cumplir los objetivos propuestos en esta tesis doctoral, utilizamos ratones C57BL/6 (B6.129S7-Akp2tm1Sor/J) heterocigotos para Alpl (referidos como TNAP+/-), y sus compañeros de camada wild-type (WT) como controles. La administración intraperitoneal de ceruleína y LPS fue empleada como modelos in vivo de pancreatitis aguda y endotoxemia/sepsis respectivamente. Una amplia variedad de técnicas, entre ellas RT-qPCR, separación magnética celular, cultivo celular de neutrófilos y macrófagos de bazo, cavidad peritoneal y médula ósea, técnicas histológicas, citometría de flujo, ELISA, ensayos de proliferación y Western Blot, han sido utilizadas en el desarrollo de esta tesis doctoral. 4. RESULTADOS Y DICUSIÓN La pancreatitis aguda se indujo mediante la administración de ceruleína. Nuestros datos confirman que Alpl se expresa en las células acinares pancreáticas y que dicha expresión se ve notablemente incrementada por la pancreatitis. En conjunto, los ratones TNAP+/- exhibían un mayor grado de inflamación, como muestra la expresión incrementada de ciertas citoquinas (Il6, Il1b), quimioquinas (Cxcl1, Cxcl2, Ccl2), así como moléculas de adhesión y otros genes de interés (Selplg, Bax) en páncreas. Desde el punto de vista del mecanismo, nuestros resultados podrían explicarse bien por una activación aumentada de los neutrófilos o por una sensibilidad incrementada al daño de las células acinares procedentes de ratones TNAP+/- . Las principales células infiltradas en este modelo son, como ya se ha indicado, neutrófilos, los cuales expresa TNAP. La estimulación in vitro de estas células aisladas reflejó una respuesta incrementada de los neutrófilos procedentes de ratones TNAP+/-. Además, con el fin de evaluar el papel de los neutrófilos en este modelo, previo a la estimulación con ceruleína, se llevó a cabo una depleción de los neutrófilos. Pudimos observar que la depleción de estas células previno el estado inflamatorio agravado de los ratones TNAP+/-, lo que revela el papel decisivo que juegan los neutrófilos. Estos datos son consistentes con la importancia de los neutrófilos en la pancreatitis aguda y se apoya en la observación de una mayor infiltración neutrofílica en ratones TNAP+/- y la respuesta incrementada a la estimulación in vitro. El mecanismo que relaciona la TNAP y el reclutamiento y activación de los neutrófilos se desconoce, pero podría estar relacionado con la modulación del ATP extracelular, un conocido sustrato de la TNAP [33]. La regulación purinérgica ha demostrado ser esencial en la determinación de la plasticidad y heterogeneidad de los neutrófilos así como en la orquestación de sus complejas funciones durante la inflamación. Así, esta regulación ha sido relacionada, entre otros, con el rodamiento, adhesión, transmigración, apoptosis, fagocitosis, explosión oxidativa, desgranulación y formación de las trampas extracelulares de los neutrófilos [34]. La estimulación de los receptores P2 por ATP facilita la activación del sistema inmune, mientras que la unión de adenosina al receptor P1 principalmente restringe la activación inmune [35]. Dado que TNAP degrada ATP, es posible que la deficiencia de TNAP propicie un incremento en la ratio ATP/adenosina, induciendo, en consecuencia, un estado proinflamatorio. Se analizó la implicación de las células acinares, primero mediante su aislamiento de ratones con pancreatitis aguda inducida por ceruleína, y, en segundo lugar por medio de la estimulación in vitro de células acinares aisladas con ceruleína. En el primer experimento, las células acinares de ratones TNAP+/- mostraron una expresión incrementada de Cxcl2, Il6 y Selplg, mientras que en el segundo, pudimos detectar un aumento en la expresión de Cxcl1, Cxcl2 y Il6. Conjuntamente, nuestros datos señalarían una modulación del fenotipo de las células acinares en ratones TNAP+/- , lo cual podría hacer a estas células más susceptibles a la señalización inflamatoria (incluyendo el reclutamiento de los neutrófilos) y/o más sensibles al daño por ceruleína. Además, comprobamos que este fenotipo puede ser parcialmente reproducido mediante la inhibición directa de la enzima con levamisol, lo que sugiere que la principal conexión entre la haplodeficiencia y la respuesta incrementada a la ceruleína es un nivel reducido de TNAP. El mecanismo es desconocido pero, como sucedía con el caso de los neutrófilos, podría estar relacionado con la modulación del ATP extracelular y la regulación purinérgica, por ejemplo por medio de la activación reducida de NLRP3 mediada por el receptor P2X7 [36, 37]. A su vez, cambios en la actividad de TNAP en ratones heterocigotos puede ser atribuido a diferencias en la dinámica/velocidad de traducción, lo cual puede afectar a la glucosilación. En resumen, nuestros datos sugieren que la expresión alterada de TNAP (por expresión reducida y/o glucosilación diferente) genera una inflamación pancreática intensificada, lo cual puede ser explicado por una respuesta aumentada de los neutrófilos o bien por una mayor sensibilidad de las células acinares a la ceruleína o un perfil proinflamatorio intensificado en estas células, siendo el primero de los mecanismos descritos el más relevante. A continuación, empleamos un modelo animal de endotoxemia/sepsis inducido por administración intraperitoneal de LPS, debido a la implicación de la función barrera intestinal y la respuesta inmunológica (en gran parte de macrófagos) en esta patología. La haplodeficiencia en TNAP tuvo cierto efecto en la respuesta aguda a la endotoxemia. Así, los niveles de mRNA de Il10 y Cxcl10 en hígado fueron mayores en ratones WT respecto a los TNAP+/- , sin cambios en los niveles plasmáticos de las citoquinas IL-6, IFN-γ, y TNF-α, así como en otros parámetros analizados. En este modelo, centramos nuestra atención en los macrófagos. De manera análoga al hígado, la expresión génica en macrófagos del bazo de Il10 y Cxcl10 (este último sin alcanzar la significancia estadística) fue menor en células procedente ratones TNAP+/- respecto a los ratones WT. Por su parte, los macrófagos intraperitoneales procedentes de ratones TNAP+/- mostraron una expresión reducida de IL-6, lo que, conjuntamente con una menor fosforilación de STAT3, AKT y IκB, sugiere un menor grado de activación de las vías productoras de IL-6. Con el fin de estudiar las diferencias aparentes de comportamiento entre los macrófagos procedentes de diversos tejidos, tratamos de caracterizar los macrófagos procedentes de bazo, peritoneo y médula ósea. Analizamos la proliferación, la producción de IL-6 y la polarización. No se observaron diferencias a nivel de la capacidad de proliferación y, en cuanto a la IL-6, los monocitos/macrófagos del bazo de ratones TNAP+/- tendían a producir mayores niveles, mientras que los procedentes de la cavidad peritoneal y médula ósea mostraban una producción reducida respecto a las células WT. La haplodeficiencia en TNAP afectó también a la polarización de manera diferente según el origen tisular de estas células. Por consiguiente, los monocitos/macrófagos de la cavidad peritoneal, medula ósea y bazo procedentes de ratones haplodeficientes muestran una regulación diferente entre sí por medio de un complejo mecanismo en el cual la glucosilación puede estar implicada. 5. CONCLUSIONES 1. Las células acinares de ratón expresan TNAP, la cual es inducida en el modelo de pancreatitis aguda por ceruleína. Las células acinares procedentes de ratones TNAP+/- muestran una mayor sensibilidad al daño por ceruleína 2. Los neutrófilos procedentes de ratones TNAP+/- muestran una respuesta incrementada a la estimulación in vitro con LPS 3. Los ratones TNAP+/- exhiben una sensibilidad incrementada a la pancreatitis aguda inducida por ceruleína. El mecanismo implica una respuesta inflamatoria aumentada de las células acinares así como de los neutrófilos. La constatación de que la depleción de los neutrófilos prevenía la mayoría de diferencias descritas, indica que los neutrófilos son el componente principal del fenotipo observado 4. La haplodeficiencia de TNAP en ratón afecta a la respuesta aguda a la endotoxemia. El mecanismo es complejo y requiere investigaciones futuras 5. Los monocitos del bazo expresan TNAP y su respuesta al LPS es modulada por inhibidores enzimáticas o por la haplodeficiencia de TNAP 6. Los monocitos intraperitoneales y de medula ósea procedentes de ratones haplodeficientes muestran una regulación diferente entre sí y también respecto a los procedentes del bazo. Este dato sugiere que la TNAP juega un papel importante en las tres poblaciones 7. Debido a sus efectos inmunomoduladores sobre diferentes poblaciones celulares, la TNAP puede ser una diana farmacológica útil en el futuro   REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Millan, J.L., Alkaline Phosphatases : Structure, substrate specificity and functional relatedness to other members of a large superfamily of enzymes. Purinergic Signal, 2006. 2(2): p. 335-41. 2. Millan, J.L. and M.P. Whyte, Alkaline Phosphatase and Hypophosphatasia. Calcif Tissue Int, 2016. 98(4): p. 398-416. 3. Weiss, M.J., et al., A missense mutation in the human liver/bone/kidney alkaline phosphatase gene causing a lethal form of hypophosphatasia. Proc Natl Acad Sci U S A, 1988. 85(20): p. 7666-9. 4. 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