Insights into c-di-GMP signaling and the PGA exopolysaccharide biological functions using "Salmonella" as a model organism

Resumen

Salmonella es un patógeno alimentario de gran relevancia clínica capaz de adherirse a superficies y formar comunidades bacterianas embebidas en una matriz que ellas mismas producen denominadas biofilms. Esta matriz confiere a las bacterias protección frente a agentes externos, aumentando su tolerancia frente a condiciones ambientales adversas, agentes antimicrobianos o el sistema inmune del hospedador. Existe una vía de señalización, mediada por el dinucleótido cíclico, c-di-GMP, que controla en muchas especies bacterianas la síntesis de diversos componentes de la matriz del biofilm, de manera que concentraciones elevadas de este nucleótido activan la producción de la matriz y por lo tanto del biofilm. La formación de biofilms en explotaciones agropecuarias y lugares donde se procesan alimentos es una fuente potencial de contaminación y de transmisión de este patógeno. Diversas medidas de higiene y seguimiento han sido implementadas por las autoridades para el control de esta bacteria; sin embargo alrededor de 93 millones de personas en todo el mundo sufren salmonelosis cada año. Por ello, la búsqueda de medidas alternativas de control, basadas en la vacunación animal, así como el estudio de los mecanismos de patogenicidad y formación de biofilm de Salmonella han sido el objeto de este trabajo. La primera parte de esta tesis se ha dedicado a la evaluación de una cepa atenuada de Salmonella para su posible uso como cepa vacunal. En primer lugar, se analizó la implicación del sistema de señalización mediado por c-di-GMP en la virulencia de Salmonella mediante la comparación, en diversos modelos de infección en ratón, de la virulencia de una cepa salvaje y de una cepa mutante múltiple en todos los genes responsables de la síntesis de c-di-GMP, y por lo tanto incapaz de sintetizar c-di-GMP. Este mutante presentó una atenuación moderada, indicando que el sistema de señalización del c-di-GMP es necesario durante la infección. La mutación adicional, en este mutante, del gen rpoS dio lugar a una cepa, denominada ΔXIII, muy atenuada y capaz de inducir una respuesta inmune protectora frente a un desafío con una cepa virulenta de S. Typhimurium. Además, esta cepa vacunal presenta una serie de características que indican que no sería capaz de sobrevivir en el ambiente y que, por otra parte, permitirían la diferenciación de animales vacunados y no vacunados. Por todo ello, se propone el uso de la cepa ΔXIII como una cepa vacunal viva y atenuada para la protección frente a Salmonella de los animales implicados en la transmisión de esta bacteria. Posteriormente y recogido en el capítulo dos, hemos estudiado la implicación del receptor eucariota del c-di-GMP, denominado STING (STimulator of INterferon Genes), durante la infección por Salmonella. Recientemente se ha descrito que STING es una proteína de la célula huésped capaz de unir c-di-GMP y generar una respuesta inmune a través de la producción de interferón. Sin embargo se desconoce si en el caso de Salmonella, tal y como ocurre en otras bacterias, esta producción de IFN puede suponer una estrategia de la bacteria para modular la respuesta inmune del hospedador, o por el contrario la activación de STING representa un mecanismo del huésped de protección frente a la infección. Para llevar a cabo este estudio, hemos utilizado una cepa salvaje y el mutante múltiple incapaz de sintetizar c-di-GMP y hemos realizado infecciones in vitro e in vivo utilizando ratones salvajes y mutantes en STING. Nuestros resultados indican que la infección de macrófagos con Salmonella da lugar a la producción de IFN-β mediada por STING, independientemente de la presencia de c-di-GMP. Por otra parte, tanto la cepa salvaje de Salmonella como el mutante en c-di-GMP son capaces de infectar de igual manera ratones salvajes y deficientes en STING, lo cual demuestra que ni el reconocimiento del c-di-GMP a través de STING ni cualquier otro mecanismo de activación de STING juegan un papel relevante en el resultado de la infección por Salmonella. Por último, en el capítulo tres, hemos estudiado las razones por las cuales Salmonella no presenta en su genoma los genes necesarios para la síntesis del exopolisacárido PGA (poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine). La matriz del biofilm de Salmonella está formada fundamentalmente por el exopolisacárido celulosa; sin embargo otras enterobacterias como Escherichia coli además de sintetizar celulosa, recurren también al exopolisacarido PGA para la formación del biofilm. Teniendo en cuenta que Salmonella y E. coli se encuentran filogenéticamente muy relacionadas pero sus ciclos de vida son muy diferentes, nos planteamos que tal vez la ausencia de PGA supuso un evento evolutivo de diversificación entre estas especies. El análisis filogenético comparativo de genomas de enterobacterias sugiere que Salmonella perdió los genes implicados en la síntesis de PGA después de la diversificación de los géneros Salmonella y Citrobacter y antes de la diversificación de las distintas especies de Salmonella. Mediante la expresión heteróloga del polisacárido PGA de Escherichia coli en Salmonella hemos podido determinar que al igual que ocurre en E. coli, la síntesis de PGA es dependiente de c-di-GMP. Hemos observado que la producción de PGA da lugar a la formación de un biofilm muy diferente a nivel estructural de la celulosa que no proporciona una ventaja adicional para la supervivencia de la bacteria frente a diferentes estreses ambientales. Por otra parte, la producción de PGA resulta muy perjudicial para la supervivencia de Salmonella dentro del huésped, ya que aumenta la sensibilidad a las sales biliares y especies reactivas de oxigeno, comprometiendo su capacidad de supervivencia en macrófagos y la colonización de órganos incluyendo la vesícula biliar. Por lo tanto, nuestros resultados indican que el PGA es un factor antivirulencia en Salmonella, cuya pérdida supuso una estrategia evolutiva necesaria para garantizar la colonización y supervivencia en el huésped.