Secreción, procesamiento proteolítico e interacciones moleculares de miocilinaimplicaciones en la relación genotipo-fenotipo en glaucoma

Resumen

Se denomina glaucoma a un conjunto de neuropatías ópticas que producen una pérdida de visión asociada a la muerte apoptótica de las células ganglionares de la retina. Los glaucomas constituyen la principal causa de ceguera irreversible en los países desarrollados. La forma más común, el glaucoma primario de ángulo abierto del adulto (GPAA), generalmente está asociado a un incremento de presión intraocular, debido principalmente al aumento de la resistencia al drenaje del humor acuoso a través de la red trabecular. Aunque existen casos de herencia monogénica, la mayor parte de los casos presentan un patrón de herencia complejo. El fenotipo patológico depende de múltiples factores genéticos y probablemente ambientales. Aunque se ha encontrado asociación del glaucoma con al menos 20 loci distintos, se desconocen la mayor parte de los genes implicados. El primer gen implicado en GPAA de herencia monogénica fue el gen MYOC. También se han encontrado mutaciones de este gen en el 3-5% de pacientes con GPAA de herencia compleja. A pesar de la intensa investigación realizada desde su descubrimiento en 1997, la función del gen sigue siendo desconocida. Igualmente, no se ha dilucidado completamente el mecanismo por el que las mutaciones en el gen MYOC causan glaucoma. Este gen presenta una expresión especialmente abundante en el cuerpo ciliar del ojo, músculo esquelético y corazón. Posee tres exones y codifica una proteína de 504 aminoácidos, llamada miocilina, presente en el humor acuoso y en la matriz extracelular de la red trabecular. El glaucoma debido a mutaciones en MYOC generalmente se asocia a un aumento de la presión intraocular (PIO). Miocilina interacciona con diversas proteínas extracelulares a través de sus dominios amino y carboxilo terminales. Estas interacciones podrían desempeñar un papel importante en la regulación de la presión intraocular. Por ello, el objetivo general de este trabajo ha sido analizar la función de miocilina, estudiando su expresión en líneas celulares eucariotas y sus interacciones moleculares, así como el mecanismo molecular por el que las mutaciones del gen MYOC producen glaucoma. La metodología experimental consistió principalmente en comparar el comportamiento de miocilina humana recombinante silvestre y mutante, expresadas transitoriamente en distintas líneas celulares de mamífero en cultivo. Las proteínas recombinantes se detectaron mediante transferencia Western e inmunocitoquímica. Para caracterizar las interacciones moleculares de miocilina se utilizaron las técnicas de doble híbrido de levadura y el análisis en fase sólida. El análisis de la expresión de miocilina en líneas celulares en cultivo mostró la existencia de un procesamiento endoproteolítico intracelular en el retículo endoplasmático. Este procesamiento tiene lugar en el dominio central de la proteína, codificado por el exón 2, entre los aminoácidos Arg226 e Ile227. Este procesamiento separa el extremo carboxilo terminal, que es secretado, del amino terminal, que es mayoritariamente retenido dentro de la célula. La inmunodetección, mediante transferencia Western, de miocilina en tejidos oculares humanos y bovinos mostró este mismo fragmento C-terminal, indicando que el procesamiento observado en los cultivos celulares es un proceso fisiológico que también ocurre en el ojo. El estudio de la regulación del procesamiento indicó que el bicarbonato presente en el medio de cultivo modula la proporción extracelular de fragmento C-terminal. Este hallazgo puede tener una importante implicación fisiológica, ya que el bicarbonato es un compuesto abundante en el humor acuoso (20 ¿mol/ml) que juega un papel central en la secreción del humor acuoso por el epitelio ciliar. El estudio de la expresión de formas mutantes de miocilina demostró que éstas se acumulan intracelularmente y su procesamiento proteolítico está reducido. La coexpresión de miocilina silvestre con formas mutantes como modelo celular de heterocigosis, dio lugar a un aumento en la secreción de miocilina mutante y a la reducción de la presencia extracelular del fragmento C-terminal de miocilina silvestre. En estos fenómenos podría participar la formación de hetero-agregados miocilina silvestre/mutante. El análisis de las interacciones de miocilina mostró que miocilina forma agregados covalentes de alto peso molecular consigo misma a través de puentes disulfuro intermoleculares establecidos por el dominio N-terminal, e interacciona no-covalentemente a través del extremo C-terminal con otras proteínas presentes en la matriz extracelular como hevin, sparc, fibronectina y laminina. El procesamiento proteolítico reduce la afinidad de miocilina por estas proteínas de matriz y disminuye la cantidad de agregados de miocilina. En conjunto, estos datos sugieren un posible papel de miocilina y de su procesamiento proteolítico en la regulación de la presión intraocular. Las diferencias descritas entre las interacciones moleculares de miocilina completa y su fragmento C-terminal podrían modificar la resistencia al drenaje de humor acuoso en las vías trabecular y uveoescleral, modulando así la presión intraocular. Adicionalmente, estos datos permiten proponer dos nuevos posibles mecanismos patogénicos para las mutaciones en miocilina, mediados por la presencia extracelular de formas mutantes con una posible ganancia de función y por la reducción extracelular de fragmento C-terminal silvestre.