Generación de un fragmento recombinante del brazo largo de la laminina 111caracterización estructural y funcional

Resumen

El proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de preexistentes se denomina angiogénesis y desempeña un papel fundamental en numerosos procesos biológicos durante el desarrollo embrionario y en la vida postnatal: reproducción, cicatrización e inflamación. El crecimiento incontrolado de los vasos sanguíneos es un trastorno subyacente en numerosas patologías: artritis reumatoide, retinopatía diabética, crecimiento y expansión de los tumores sólidos, etc. Aunque los mecanismos moleculares responsables de la transición de una célula endotelial (CE) hacia un fenotipo angiogénico no son bien conocidos, la secuencia de eventos que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos está bien documentada. El conocimiento preciso de los mecanismos moleculares que controlan el proceso de neoformación vascular es un área de extensa investigación ya que la posibilidad de inhibir (o estimular) el crecimiento vascular puede ser una importante herramienta terapapéutica. Numerosas evidencias experimentales indican que el crecimiento tumoral progresivo depende del constante aporte de nuevos vasos sanguíneos. La mayoría de los tumores persisten in situ en un estado quiescente avascular durante largos periodos de tiempo (meses o años). EL cambio (¿switch¿) en el equilibrio local entre factores reguladores negativos y positivos, en general debido a u subgrupo de células dentro del tumor cambia hacia un fenotipo angiogénico, hace que el tumor empiece a crecer rápidamente y llegue a ser clínicamente detectable. En ausencia de la vascularización adecuada las células tumorales sufren un proceso de necrosis y/o apoptosis, lo cual inhibe o modera significativamente el incremento del volumen tumoral. Tradicionalmente se ha considerado que los procesos de angiogénesis tumoral implican la formación de ¿brotes¿ a partir de vasos preexistentes, o más raramente, su ¿tabicación¿. Pero recientemente se ha descrito un tercer mecanismo, consistente en la incorporación de células precursoras (CPs) derivadas de médula ósea. Diferentes estudios indican que la administración sistémica de agentes antiangiogénicos tiene actividad antitumoral. Se han descrito varios tipos de terapias antiangiogénicas que interfieren con el proceso de neoformación vascular a diferentes niveles. Bloqueando la actividad de uno o varios factores angiogénicos (Fas), inhibiendo las proteinasas que degradan la matriz extracelular (ECM), actuando directamente sobre las CEs, regulando por exceso los inhibidores endógenos. Recientemente se han publicado estudios centrados en componentes de la matriz extracelular (MEC), por ser el soporte de CEs actúan modulando su viabilidad, movimiento y reorganización, pueden tener un gran potencial terapéutico en la modulación del proceso angiogénico. Uno de los más conocidos es el dominio ED-B de fibronectina producido por splicing alternativo, restringido únicamente a vasos angiogénico. Estrategias de fusión del Ab del dominio de la MEC, ED-B, junto con factores de tejido7 o IL-128 favorece la actividad antitumoral de estas proteínas. Estos estudios demuestran que los componentes de la MEC constituyen una poderosa herramienta para el desarrollo de agentes antiangiogénicos, pero el empleo de la MEC por sí sola sigue siendo un área inexplorada. Es bien sabido que la deposición de la membrana basal (MB) desempeña un papel crucial en el desarrollo, organización y maduración de los vasos sanguíneos, y recientemente se ha visto implicada en la formación de vasculatura tumoral. La acción morfogenética de la BM depende de la capacidad para unir receptores específicos de superficie celular. Por lo que proponemos la interrupción de estas interacciones como una novedosa estrategia terapeútica. Nuestro grupo se ha centrado en la molécula de laminina (LM) componente mayoritario de la BM, como marcador terapéutico antiangiogénico10,11. La molécula de LM es una glicoproteína de matriz intimamente involucrada en adhesión, proliferación celular y morfogénesis capilar. Hasta la fecha la mayoría de los datos estructurales y funcionales de esta molécula se han realizado empleando mediante fragmentos proteolíticos o péptidos sintéticos, no obstante el uso terapéutico de estos últimos conlleva una serie de desventajas debido a su escasa vida media. No obstante nuestro grupo ha desarrollado un sistema para generar AcMos recombinantes frente a proteínas de la ECM e identificar aquellos capaces de modular procesos de morfogénesis capilar y de inhibir el crecimiento tumoral. La incorporación de AcMos recombinantes con formato monocadena, mono o biespecíficos, en armazones proteicos derivados de la MB que contienen IEAs, representa una nueva estrategia para producir agentes multiespecíficos capaces de bloquear de forma simultánea dos o más dianas implicadas en el proceso de angiogénesis (TERAPIA COMBINADA). Además la incorporación de secuencias sensibles a proteinasa permitirá incrementar la especificidad de esta nueva modalidad terapéutica. Mediante la tecnología de Phage Display nuestro grupo desarrolló un Ab monoclonal en formato monocadena L36 que inhibía la formación de capilares in vitro e inhibía la angiogénesos in vivo cuyo epítopo se encontraba en la triple helice (dominio coiled-coil) del brazo largo de la laminina, y estaba constituido por residuos de la cadena alpha y de la cadena gamma. Hasta la fecha los estudios realizados se centraban en la molécula intacta o bien en fragmentos proteolíticos que contenían regiones globulares (LN) a los que se les atribuía la actividad de la molécula16. Es por este motivo que consideramos de especial interés profundizar en la caracterización estructural y funcional de esta región coiled-coild de la molécula de LM. Para ello hemos generado un fragmento de LM correspondiente a la triple helice (dominio coiled-coil) del brazo largo de la LM, en un células de mamífero, hemos realizado una detallada caracterización estructural y estudiado su influencia sobre adhesión, movilidad y expresión génica.