Identificación de nuevos biomarcadores para predecir el riesgo de diabetes mellitus tipo 2 en pacientes con enfermedad cardiovascularestudio cordioprev-diab

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis En los últimos años, la prevalencia de diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) ha aumentado considerablemente. De hecho, se estima que el número actual de pacientes con DMT2 se duplicará en las próximas dos décadas con cifras similares para la obesidad [1]. Por otra parte, la DMT2 puede permanecer sin diagnosticar durante muchos años porque la hiperglucemia se desarrolla de forma gradual, y, en etapas tempranas, no es lo suficientemente severa como para ser detectada [2]. Por tanto, es crucial la identificación temprana de aquellos pacientes con alto riesgo de desarrollar DMT2 para poder diseñar estrategias de prevención y controlar los factores de riesgo de la enfermedad. Los biomarcadores tradicionales usados para identificar pacientes en riesgo de desarrollo de la enfermedad, entre los que se encuentran la glucosa plasmática en ayunas, la glucosa tras 2 horas del OGTT, hemoglobina glicada (HbA1c), parámetros relacionados con la homeostasis de glucosa, especies lipídicas y test como el Finnish Diabetes Risk Score (FINDRISC), muestran ciertas limitaciones y no son lo suficientemente eficientes y precisos [3-6]. Por ello, es necesaria la búsqueda de nuevos biomarcadores que mejoren la sensibilidad, la especificidad y aumenten el valor predictivo. La resistencia a la insulina (IR) y el deterioro de la función de las células beta son factores determinantes del desarrollo de DMT2 [7]. Estudios previos han demostrado el papel de la endotoxemia en el desarrollo de resistencia a la insulina. La absorción intestinal de componentes bacterianos, como el lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram negativas, activa los receptores tipo toll induciendo inflamación, y esto a su vez IR [8]. Sin embargo, esta secuencia de eventos no está bien establecida, y aún no está claro si la IR precede a los cambios en la microbiota o viceversa [9]. Recientemente, se ha sugerido la asociación entre la endotoxemia y el riesgo de desarrollar DMT2, no obstante, los resultados obtenidos se vieron afectados por diversos parámetros no controlados [10]. Adicionalmente, los microARNs (miRNAs) son reconocidos como importantes reguladores de la expresión génica y actores centrales en el control de varios procesos biológicos y patológicos, entre los que se incluyen la señalización de la insulina y la funcionalidad de la célula beta [11]. Estudios previos sugieren el uso de los miRNAs como biomarcadores de DMT2, los cuales podrían tener una mayor sensibilidad y eficiencia para predecir el desarrollo de la enfermedad que las herramientas utilizadas actualmente[12, 13] . Sin embargo, son necesarios estudios longitudinales en poblaciones grandes de casos incidentes de DMT2 para conocer el papel de los miRNAs durante el desarrollo de la enfermedad y utilizar esa información en la búsqueda de nuevos biomarcadores predictivos. En base a estos antecedentes, nuestra hipótesis es que los niveles plasmáticos de ciertos marcadores biológicos, tales como los miRNAs, LPS y perfil de metabolitos pueden ser altamente valiosos y útiles como biomarcadores predictivos para identificar a los sujetos normoglucémicos y prediabéticos con mayor riesgo de desarrollar DMT2. 2. Contenido de la investigación El objetivo general de esta tesis doctoral se centra en identificar nuevos biomarcadores con potencial para evaluar la probabilidad y predecir el desarrollo DMT2 en pacientes con enfermedad coronaria de alto riesgo. Para dar respuesta a este punto se plantean 3 objetivos principales (que corresponden con los tres artículos derivados de esta Tesis): 1. Evaluar si la medida longitudinal de los niveles plasmáticos de LPS y de la proteína de unión a LPS (LBP) tanto en el estado de ayunas como en el postprandio, pueden mejorar la predicción de la incidencia de DMT2, en el marco del estudio CORDIOPREV. Este objetivo se aborda en la publicación “Postprandial endotoxemia may influence the development of type 2 diabetes mellitus”. 2. Identificar si los niveles de miRNAs circulantes añadidos a los marcadores clínicos y bioquímicos (HbA1c, glucosa, insulina, glucosa tras las 2 horas del test de sobrecarga oral a la glucosa (OGTT), índice de resistencia a la insulina hepática (HIRI), índice insulinogénico [IGI], índice de sensibilidad a la insulina (ISI), disposition index (DI), índice de sensibilidad a la insulina muscular (MISI), HOMA-IR y FINDRISC) podrían mejorar la predicción de DMT2. Este objetivo se aborda en la publicación “Circulating miRNAs as Predictive Biomarkers of Type 2 Diabetes Mellitus Development in Coronary Heart Disease Patients: from the CORDIOPREV Study”. 3. Estudiar si los niveles circulantes de miRNAs de acuerdo con el estatus de DMT2 o prediabetes podrían tener potencial como biomarcadores para evaluar el riesgo de desarrollar la enfermedad. Este objetivo se aborda en la publicación “A plasma circulating miRNAs profile predicts Type 2 Diabetes mellitus and prediabetes: from the CORDIOPREV study”. El objetivo secundario de esta tesis doctoral es evaluar las diferencias en los perfiles metabolómicos entre los sujetos que desarrollan y los que no desarrollan DMT2 tras 3 años de seguimiento para identificar los metabolitos con potencial como biomarcadores predictivos de la enfermedad. Artículo 1 Sujetos, diseño y metodología: En este trabajo se incluyeron todos los pacientes no diagnosticados con diabetes al inicio del estudio CORDIOPREV (NTC00924937). De ellos, 107 pacientes desarrollaron DMT2 de acuerdo con los criterios de diagnóstico de la Sociedad Americada de Diabetes (ADA) tras una mediana de seguimiento de 60 meses (grupo Incident-DIAB). Se llevó a cabo una sobrecarga grasa y una sobrecarga oral de glucosa (OGTT) en días consecutivos al inicio del estudio y tras 3 años de seguimiento. Seguidamente, se determinaron los niveles plasmáticos de LPS, LBP (proteína de unión a lipopolisacárido), IL-6, MCP1 y TNF-alpha. Por último, se realizaron análisis de regresión de COX para evaluar el potencial de los niveles postprandiales de LPS como predictor del desarrollo de DMT2. Resultados: Observamos un aumento en los niveles de LPS postprandiales en la situación basal en los pacientes que desarrollan diabetes (P < 0.001), mientras que no se encontraron cambios en el grupo de no-diabéticos. El análisis de regresión de COX, basado en los cambios postprandiales de LPS, mejoró el poder predictivo del desarrollo de DMT2 en comparación con el FINDRISC (hazard ratio de 2.076, 95% CI 1.149-3.750 vs. 1.384, 95% CI 0.740-2.589). Además, el análisis de regresión de COX combinando ambos parámetros mostró que los pacientes con niveles postprandiales elevados de LPS y alto FINDRISC tienen un mayor riesgo de desarrollo de diabetes (hazard ratio de 3.835 (95% CI 1.323-11.114)). Artículo 2 Sujetos, diseño y metodología: Este trabajo se llevó a cabo en la misma población no diabética al inicio del estudio CORDIOPREV. Los niveles plasmáticos de 24 miRNAs se determinaron en la situación basal mediante qRT-PCR. Además, se realizaron análisis de componentes principales (OPLS-DA), curvas ROC y de regresión de COX para evaluar el poder predictivo de los miRNAs circulantes en el desarrollo de DMT2. Resultados: El análisis de ROC identificó 9 miRNAs, los cuales, añadidos a la HbA1c, tienen un mayor valor predictico en el diagnóstico temprano de la DMT2 (AUC = 0.8342), en comparación con la HbA1c (AUC = 0.6950). Este modelo de miRNAs y HbA1c no mejoró cuando se incluyó el FINDRISC (AUC = 0.8293). El análisis de regresión de COX mostró que los pacientes con bajos niveles circulantes de miR-103, miR-28-3p, miR-29a, y miR-9, y, altos de miR-30a-5p y miR-150 en la situación basal tienen mayor riesgo de desarrollar la enfermedad (HR = 11.27; 95% CI = 2.61–48.65). Artículo 3 Sujetos, diseño y metodología: Se incluyeron los 462 pacientes sin diabetes al inicio del estudio CORDIOPREV. Tras una mediana de seguimiento de 60 meses, 107 de ellos desarrollaron DMT2, 30 desarrollaron prediabetes, 223 mantuvieron la prediabetes y 78 estaban libres de enfermedad. Los niveles plasmáticos de cuatro miRNAs relacionados con la señalización de la insulina y la funcionalidad de la célula beta se determinaron mediante qRT-PCR. Adicionalmente, analizamos la relación entre los niveles de miRNAs y los índices relacionados con la señalización de la insulina en la situación basal y después del periodo de seguimiento. El riesgo de desarrollar la enfermedad fue evaluado mediante análisis de regresión de COX en función de los niveles de miRNAs en la situación basal categorizados por tertiles. Resultados: Observamos mayores niveles de miR-150 y miR-30a-5p y menores niveles de miR-15a y miR-375 en la situación basal en aquellos pacientes que desarrollan DMT2, en comparación con los pacientes que no la desarrollan. Además, los pacientes con niveles altos de miR-150 y miR-30a-5p mostraron una peor funcionalidad de la célula beta (menor disposition index) (p=0.047 y p= 0.007, respectivamente). Por último, un alto riesgo de desarrollo de DMT2 también se asoció con altos niveles (T3) de miR-150 y miR-30a-5p (HRT3-T1 = 4.218 y HRT3-T1 = 2.527, respectivamente), y bajos niveles (T1) de miR-15a y miR-375 (HRT1-T3 = 3.269 and HRT1-T3 = 1.604, respectivamente) en la situación basal. Otra aproximación Sujetos, diseño y metodología: Seleccionamos un grupo de 52 pacientes sin diabetes al inicio del estudio CORDIOPREV, 26 de los cuales desarrollaron la enfermedad tras 3 años de seguimiento y otros 26 que no la desarrollaron. Estudiamos las diferencias en el perfil metabolómico entre ambos grupos en muestras de plasma tomadas en la situación basal, tanto en el estado de ayuno como en el postprandial. Se llevaron a cabo análisis de componentes principales (PLS-DA y OPLS-DA) y de curvas ROC con los niveles plasmáticos de los metabolitos identificados para evaluar el poder predictivo del desarrollo de DMT2. Resultados: Nuestro estudio sugiere que el perfil de metabolitos en la situación basal, tanto en el estado de ayunas como en el postprandio, permite diferenciar entre sujetos que desarrollan DMT2 y aquellos que no la desarrollan tras tres años de seguimiento. De hecho, el análisis de curvas ROC mostró que los niveles plasmáticos de metabolitos específicos podrían tener potencial como biomarcadores predictivos del desarrollo de la enfermedad. Nuestros resultados mostraron un AUC de 0.794 (sensibilidad = 0,808, especificidad= 0.731 y precisión= 72.8%) en un modelo construido con los metabolitos identificados en el estado de ayunas y con VIP>1.5, lo cuales pertenecen principalmente a la famila de las glicerofosfocholinas. Además, obtuvimos un AUC de 0.849 (sensibilidad = 0,814, especificidad= 0.727 y precisión= 74.1%) con los metabolitos identificados en el análisis postprandial, los cuales pertenecen en su mayoría a la familia de ácidos grasos. 3. Conclusión Los niveles plasmáticos de ciertos miRNAs, LPS y perfil de metabolitos podrían tener potencial como biomarcadores para evaluar la probabilidad y predecir el desarrollo de DMT2 en pacientes de alto riesgo con enfermedad coronaria. Esta conclusión general se divide en 3 apartados, los cuales se corresponden con los tres artículos de esta Tesis. 1. Una endotoxemia postprandial elevada precede al desarrollo de la DMT2 en pacientes con enfermedad coronaria y probablemente desempeña un papel clave al promover la resistencia a la insulina inducida por inflamación y / o disfunción de las células beta. Además, nuestros resultados también sugieren el papel de los niveles plasmáticos de LPS como biomarcador predictivo y como factor patógeno del desarrollo de DMT2. Conclusión del artículo 1. 2. Los niveles plasmáticos de miR-9, miR-28-3p, miR-29a, miR-30a-5p, miR-103, miR-126, miR-150, miR-223 y miR-375 añadidos a la HbA1c podrían convertirse en una nueva herramienta con gran potencial para evaluar el riesgo DMT2 en la práctica clínica y, así, poder prevenir el desarrollo de la enfermedad. Conclusión del artículo 2. 3. Los niveles plasmáticos de miR-150, miR-30a-5p, miR-15a y miR-375 están desregulados años antes del inicio de DMT2 y prediabetes y podrían ser usados para evaluar el riesgo de desarrollar la enfermedad, lo que podría mejorar la predicción y la prevención en pacientes con alto riesgo. Conclusión del artículo 3. 4. El perfil metabolómico se altera en pacientes con DMT2 varios años antes del inicio de la enfermedad. Ciertos metabolitos entre los que se incluyen lisofosfatidilcolinas; aminoácidos tales como la arginina; ácido mirístico; HODE; y los ácidos biliares como el glicochenodesoxicólico podrían convertirse en valiosos biomarcadores para la predicción del desarrollo de la DMT2. 4. Bibliografía 1. Nations, U., Resolution 66/2. Political Declaration of the High-Level Meeting of the General Assembly on the Prevention and Control of Noncommunicable Diseases. . Sixty-sixth session ofthe United Nations General Assembly. New York, 2011. 2. Association, A.D., 2. 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